摘要：在当今追求碳中和的时代，甲醇以其低成本、高丰度和来源广泛的优势，成为备受瞩目的绿色能源和化工原料。从工业废气到生物质转化，甲醇的生产过程具备极强的可持续性。同时，作为一种一碳（C1）化合物，甲醇可以通过微生物转化生成多种高价值化学品和生物燃料，为绿色生物制造带

在当今追求碳中和的时代，甲醇以其低成本、高丰度和来源广泛的优势，成为备受瞩目的绿色能源和化工原料。从工业废气到生物质转化，甲醇的生产过程具备极强的可持续性。同时，作为一种一碳（C1）化合物，甲醇可以通过微生物转化生成多种高价值化学品和生物燃料，为绿色生物制造带来了新的契机。

自然界中确实存在一些能够直接利用甲醇的微生物，天然甲基营养菌如甲醇芽孢杆菌，可以利用甲醇进行细胞生长和代谢，但它们面临着通过基因改造成为多功能细胞工厂以生产多种化学品的挑战。相比之下，大肠杆菌和酿酒酵母等底盘菌株具有更高的可塑性和广泛的基因改造工具，使它们成为 C1 利用和生物制造的有希望的候选菌种。

近日，江南大学的研究团队通过设计一种全新的甲醇同化途径（Synthetic Methanol Assimilation Pathway, SMA），携带 SMA 途径的大肠杆菌转化为甲基营养菌，该途径仅包含 6 种与中心碳代谢相关的酶，不需要能量和碳排放。成果登上 Nature 子刊“Nature Communications”，题为“A synthetic methylotroph achieves accelerated cell growth by alleviating transcription-replication conflicts。”这项研究不仅显著提升了甲醇转化效率，还将人工菌株的倍增时间缩短至 4.5 小时，接近天然甲基营养菌的生长速率。这一突破性的成果，不仅为甲醇生物制造的工业化应用开辟了新路径，也为实现循环经济和碳中和目标提供了新思路。

在这项研究中，研究团队设计了一个由 6 种关键酶组成的 SMA 途径。SMA 途径以甲醇为起点，通过甲醇氧化、甲醇固定、碳重排三大模块协同工作，将甲醇转化为乙酰辅酶 A（C2）。

首先由甲醇脱氢酶（MDH）催化，将甲醇氧化为甲醛（C1），这是甲醇同化的第一步；再利用乙醇醛合酶 (GALS) 、己糖磷酸醛缩酶（HSA）和己糖磷酸异构酶（PHI），将两分子甲醛和一分子 4-磷酸赤藓糖（E4P）催化合成 6-磷酸果糖（F6P）。这一过程实现了碳分子的高效固定。最后 6-磷酸果糖通过磷酸酮醇酶（FPK）和磷酸转乙酰酶（PTA）转化为乙酰辅酶 A，同时再生 E4P 进入下一个循环。该路径的独特之处在于无需额外的能量（如 ATP）消耗，也没有碳排放，实现了高效、碳中和的甲醇同化过程。

图 | SMA 通路的设计和构建（来源：上述论文）

为了确保 SMA 途径的可行性，研究团队从热力学和能量效率分析等方面进行了验证。结果显示，总吉布斯自由能约为-78.2 kJ/mol，表明在热力学上可行；同时，SMA 途径不消耗 ATP 或 NAD(P)H，显示出代谢经济性，且乙酰辅酶 A 产量在同类路径中表现优异，是一种竞争力强的代谢设计。研究团队通过体外实验验证了 SMA 途径的功能，并对限速酶进行了优化。优化后的 SMA 途径为后续的合成甲基营养菌构建奠定了坚实的基础。

研究团队通过理性设计和实验室进化的方法，成功将优化后的 SMA 途径引入大肠杆菌中，以建立能够高效利用甲醇的工程菌株。这一过程中，他们通过三种重组质粒分别编码 SMA 途径的关键酶，并在大肠杆菌的代谢网络中实现表达，同时删除了可能干扰甲醇同化的基因，并通过过表达辅助基因来增强代谢通量的循环效率。这些初步改造使菌株在含甲醇的培养基中展现出一定的生长能力，尽管其倍增时间较长，且对甲醇的依赖性较低。

为了进一步提高菌株的甲醇利用能力，研究团队采用了基因组靶向突变策略（GTMS）结合实验室自适应进化的方法，将菌株置于含甲醇和低浓度木糖的培养基中，经过约 140 天和超过 200 次传代，最终获得了能够以甲醇为唯一碳源生长的菌株 FMX892。进化后的菌株在甲醇利用效率上显著提升，最大光密度（OD600）达到 2.2，倍增时间缩短至 4.5 小时，接近天然甲基营养菌。

此外，通过13C 标记实验，研究人员确认了甲醇的碳被成功转化为细胞代谢中的重要中间体，如丙酮酸和天冬氨酸，进一步显示了甲醇通过 SMA 途径进入核心代谢网络，从而支持细胞生长和生物量合成。这些改造和进化步骤成功构建了具备甲基营养能力的人工大肠杆菌，为后续的分子机制研究提供了重要模型。

图 | 通过理性设计和定向进化成功构建了能够高效同化甲醇的合成甲基营养菌（来源：上述论文）

在研究合成甲基营养菌的生长过程中，初期菌株如 FMX506 的倍增时间长达 79.2 小时，远高于进化后菌株 FMX892。研究人员原以为甲醛积累是生长缓慢的原因，但实验显示甲醛浓度低于毒性阈值，排除了这一可能性。实际上，早期菌株的生长延迟与 DNA 复制速率降低有关。

进一步的分析发现 DNA 复制受阻与转录-复制冲突（TRCs）有关。在大肠杆菌中，转录和 DNA 复制同时发生在同一 DNA 模板上，这可能导致 TRC。因此认为 TRCs 是导致合成甲基营养菌倍增时间延长的主要因素。

通过组学测序分析和逆向代谢工程验证相结合，证明了 TOPAI 基因的过度表达导致大肠杆菌的拓扑异构酶I（EcTopoI）与 RNAP 的解偶联，进而导致 R 环的积累和 RNAP 的停滞，从而加剧了菌株 FMX783 中的 TRC。进化过程最终缓解了 TOPAI 的这种缺陷，缓解了潜在的 TRC，并恢复了菌株 FMX892 在甲醇上的正常生长速度。

文章中也提到，未来的研究将旨在阻止 EcTopoI 与 RNAP 的解偶联以抑制 R 环的过度积累，从而缓解 TRC 并逐步增强合成甲基营养菌的生长。

江南大学研究团队的这项工作展示了合成生物学在解决能源与环境问题中的强大能力，同时为甲醇生物制造技术的工业化应用指明了方向。研究中对 TRCs 和 TOPAI 基因调控机制的解析，为未来解决其他代谢瓶颈问题提供了有价值的理论基础。通过持续的研究与创新，未来我们或许能够实现真正的“碳循环经济”，让化学工业焕发出全新的绿色生机。

参考链接：

1.Meng, X., Hu, G., Li, X. et al. A synthetic methylotroph achieves accelerated cell growth by alleviating transcription-replication conflicts. Nat Commun 16, 31 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-024-55502-5

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来源：生辉SciPhi