PBJ | 美国佛罗里达大学研究团队开发出连续定向进化（CDE）新系统

摘要：连续定向进化（CDE）通过在生物体内对目标酶基因进行超突变，将酶活性与微生物平台的生长相耦合，并选择生长速率来改善目标酶的特性。定向进化可以与基因组编辑相结合，以扩大可用于植物育种的基因库；这种强大的组合（DE-GE）被巧妙地称为“绿色（r）进化。THI4 酶

连续定向进化（CDE）通过在生物体内对目标酶基因进行超突变，将酶活性与微生物平台的生长相耦合，并选择生长速率来改善目标酶的特性。定向进化可以与基因组编辑相结合，以扩大可用于植物育种的基因库；这种强大的组合（DE-GE）被巧妙地称为“绿色（r）进化。THI4 酶负责合成硫胺素中的噻唑部分，是植物 CDE 技术的良好测试目标。植物的 THI4 酶是能量利用效率低下的自杀酶，有可能被高效的非自杀型细菌 THI4 酶所取代，从而将生物量产量提高多达 4%。然而，细菌的 THI4 酶对氧气敏感，且在其他方面也不适合植物。

近日，美国佛罗里达大学园艺科学系的Andrew D. Hanson团队在国际知名杂志Plant Biotechnology Journal发表了题为“Mirages in continuous directed enzyme evolution: a cautionary case study with plantized bacterial THI4enzymes”的文章。他们在酵母 OrthoRep 系统中开展了 CDE 活动，以“植物化”细菌的 THI4 酶，即在有氧、类似植物的环境中改善其功能。其中两个特别成功的活动是针对来自水蛭黏液食杆菌（Mucinivorans hirudinis）的 THI4 酶（MhTHI4）开展的；这些实验最终达到了这样的结果：当种群获得单个 V124A 或 Y122C 突变时，其生长速度接近野生型。

在本研究中，他们通过降低 MhTHI4 目标基因的表达来加大选择压力，从而降低酶活性和细胞生长速率，重新为改进提供空间。在 OrthoRep 中，可以通过缩短目标基因 mRNA 的基因编码poly(A) 尾或减少携带目标基因质粒（p1）的拷贝数来降低表达。这些操作导致了生长更快的种群的出现，这些种群携带了 MhTHI4 的新非同义突变以及同义突变。令人惊讶的是，测试表明，同义突变可能是生长速率提高的主要原因或全部原因。鉴于此类“幻象”在其他 OrthoRep CDE 项目中出现的可能性很大。

他们之前针对 MhTHI4 的实验使用的是商业编码基因，其中 V124A 突变体是本次实验的起点。与之前一样，实验平台菌株为 BY4741 thi4Δ，其生长需要噻唑前体（HET）或硫胺素。为降低表达量，将poly(A) 尾从约 72 个腺苷酸缩短至 24 个腺苷酸或 0 个腺苷酸，分别使表达量降低两倍或十倍。为减少 p1 拷贝数，将错配 DNA 聚合酶从 TP-DNAP1_611 更改为 TP-DNAP1_633，这也会提高突变率。每种表达降低方案均被证实能如预期般发挥作用，然后与“突然淘汰”选择（培养时不添加硫胺素或 HET）或“逐步淘汰”选择（初始补充限制性硫胺素或 HET，即逐渐减少至零）相结合。传代培养周期为每 4 至 6 天一次。针对 V124A 突变体的每种表达降低方案，分别构建了 9 个独立的菌群，并进行突然淘汰或逐步淘汰选择，从而得到 54 个初始亚群。未补充营养物质而存活下来的亚群被分为三组（分别标记为 A、B、C），并独立繁殖。当生长速度趋于平稳时，实验结束。对亚群的总 DNA 进行测序，以识别出感兴趣的突变，即那些已完全取代野生型碱基（在亚群中“席卷”）的突变。

事实证明，突然淘汰的策略是有效的；33代后得到两个亚种群（无A尾的V124A和带TP-DNAP_633的V124A），每代结束时分裂值均达到OD600 1.5 ~ 5.0。总的来说，在选定的亚群中发现了11个非同义突变和9个同义突变(以及两个10B2启动子突变，很可能是中性的，因为10B2已经优化。值得注意的非同义突变是V124A的逆转和Y122C的取代；这个开关意味着Y122C在在功能上更胜一筹。

总而言之：本文所述的密码子偏差问题，就像酵母对特定蛋白质中特定位置的不同氨基酸的偏好一样，在使用OrthoRep作为改进植物酶的平台时，必须警惕地监测。然而，密码子和氨基酸的偏倚并不会损害OrthoRep的进化能力，因为它们导致的DNA或蛋白质序列的酵母菌化特征可以迅速被识别和拒绝。未雨绸缪。