摘要：生物体内各种微妙的生化级联过程通常局限于细胞内，它们在空间限制和底物通道环境下进行级联流动反应，协同作用完成复杂的生物过程。受到生命系统的启发，科学家们利用具有多种酶活性和级联催化性能的纳米酶作为级联流动反应器，其特点是成本低，具有批量生产的能力。其中，由有机
纳米酶 Nanozymes 2025年01月03日 14:01江苏
背景介绍
生物体内各种微妙的生化级联过程通常局限于细胞内，它们在空间限制和底物通道环境下进行级联流动反应，协同作用完成复杂的生物过程。受到生命系统的启发，科学家们利用具有多种酶活性和级联催化性能的纳米酶作为级联流动反应器，其特点是成本低，具有批量生产的能力。其中，由有机配体和金属离子节点连接而成的MOFs纳米酶具有可定制的孔通道、高比表面积以及类似于细胞环境的刚性和柔韧性之间的平衡等优点。同时，纳米多孔MOFs内部形成的中/宏孔洞可以在空间上形成一个受限的环境，模拟生物体内的流动过程。然而，由于缺乏类酶分子识别单元，纳米酶固有的反应选择性较差，限制了其广泛应用。因此，可以设想，如果将定义明确且高效的天然酶整合到强大的纳米酶结构中，则连续流催化的概念将显著提高到实际应用水平。
传统的天然酶固定化方法通常是基于共价结合，由于缺乏特异性的结合口袋和精细调节的催化微环境，导致酶分布不均匀或酶活性变性。幸运的是，生物识别元件可以通过氢键、空间效应、范德华力等超分子相互作用进行锚定，从而在纳米酶和天然酶之间建立结构互补，为天然酶的有效载荷提供自适应环境。在这方面，基于天然酶反应和功能性纳米酶整合的酶-纳米酶内源性系统不需要任何外部能量输入来触发催化反应，从而避免了外部触发因素的影响和限制。具体而言，被测物质在酶-纳米酶级联流动反应器中定向流动，在有限的域空间内进行级联反应，避免了传统封闭体系中分子的无序扩散，消除了开放体系的弊端。
近期，济南大学于京华教授和朱沛华教授团队，以C60@MOF-545-Fe纳米酶为骨架，乙酰胆碱酯酶为生物识别元件（方案1），构建了高效的酶-纳米酶比色连续流动反应器，并且结合深度学习搭建的智能传感平台实现多种有机磷农药的即时检测。
方案1. 用于多种OPs检测和区分的AChE/C60@MOF-545-Fe酶-纳米酶流动反应器的开发及深度学习策略的应用。
研究内容
首先成功通过一锅合成法将C60分子引入MOF-545-Fe孔道，制备出具有主客体相互作用的C60@MOF-545-Fe复合材料（图1）。研究发现，C60的引入不仅赋予了材料更加光滑的棒状微观结构，还显著调整了材料的孔隙率和比表面积。此外，拉曼光谱、XRD和FT-IR等表征证实C60的成功封装，而EDS和XPS进一步揭示了C60与MOF之间的主客体协同作用，使得功能分子均匀分布在框架内。
图1. C60@MOF-545-Fe和MOF-545-Fe的合成与表征。
C60@MOF-545-Fe在模拟酶催化活性方面表现卓越，显著优于MOF-545-Fe（图2）。通过经典显色底物ABTS、OPD和TMB的实验，C60@MOF-545-Fe在有无H₂O₂条件下分别展现出优异的类POD和OXD活性，其催化性能远高于MOF-545-Fe。这种性能提升归因于C60与MOF-545-Fe之间的独特主客体相互作用和空间限制效应，优化了底物交换并加速了催化反应。动力学研究表明，其催化反应符合米氏动力学模型，且C60@MOF-545-Fe的底物亲和力和反应速率均优于MOF-545-Fe及其他已报道的模拟酶。更值得关注的是，在最佳条件下，其类POD和OXD活性的比活性比MOF-545-Fe高出2.20倍和1.71倍。
图2. C60@MOF-545-Fe和MOF-545-Fe的类OXD和类POD活性探究。
C60@MOF-545-Fe通过模拟氧化酶(OXD)和过氧化物酶(POD)活性，展示了卓越的级联催化性能。该材料利用O₂生成活性氧(ROS)，并在主客体协同作用下将溶解氧转化为H₂O₂。电子转移与活性位点的独特设计促进了O2•−和•OH的生成，从而实现了底物的高效催化氧化。EIS和光电流测试进一步验证了C60@MOF-545-Fe优异的电荷转移能力和快速的电子-空穴分离性能。在光照下，该材料通过能带调控和Schottky势垒有效抑制了电子-空穴复合，提高了光催化效率。同时，LSV和CV测试证实了其增强的氧化还原性能。最终，C60@MOF-545-Fe成功构建了一个以Fe³⁺/Fe²⁺循环为核心的多功能催化平台，为Fenton反应和ROS生成提供了新策略。
图3. C60@MOF-545-Fe级联催化机理。
通过将脆弱的AChE分子稳定固定在C60@MOF-545-Fe骨架上，成功构建了AChE/C60@MOF-545-Fe酶-纳米酶级联流动反应器，实现了高效、精准的OPs检测。通过丰富的羧基和氨基形成的超分子相互作用，以及蛋白表面与MOF有机链节之间的氢键桥，AChE成功固定在C60@MOF-545-Fe上，同时保持了其生物活性。实验表明，该复合材料在复杂环境下具有显著的抗干扰能力和热稳定性，相比自由AChE活性降低65%-73%，AChE/C60@MOF-545-Fe的活性仅降低不超过29%，展现了极强的保护效果。此外，流动反应器通过限制性空间环境，有效筛选OPs进行级联反应，形成“OPs输入-信号输出”模式，防止中间产物的扩散损失。该系统在有机磷检测中表现出优异的灵敏度和适应性，也为酶固定化与纳米酶技术的结合开辟了新的研究方向。
图4. AChE/C60@MOF-545-Fe酶-纳米酶级联流动反应器的构建、性能及可行性研究。
所制备的AChE/C60@MOF-545-Fe的酶-纳米酶级联流动反应器，实现了草甘膦、乐果和对氧磷的灵敏检测，检测限低至0.65、0.16和0.32 ng·mL-1，并通过吸光峰值差异实现对不同OPs的定性识别。热图分析显示传感器对OPs的响应形成清晰的区域模式，可同时识别多种OPs。实际样品（大豆、苹果、稻米）的回收率达97.46%-103.79%，相对标准偏差小于4.31%，展现了优异的抗干扰性、稳定性和重复性。
图5. 基于构建的流动反应器检测三种有机磷农药。
最后，设计了一种基于比色信号和深度学习的智能手机分析平台，用于OPs的便携式现场检测。以草甘膦检测为例，该平台采用优化的YOLO v5-OPs目标检测算法，通过图像处理提取RGB和HSV信号，并利用支持向量机（SVM）进行浓度拟合，实现无需复杂仪器的精准检测。此外，该平台监测了黄河水和稻田水中草甘膦的降解行为，发现其在处理和未处理水样中分别表现出不同的降解速率和半衰期（7.55天和6.06天）。高效液相色谱（HPLC）验证了传感器的检测结果，与比色流动反应器高度一致。该智能比色传感平台不仅具备卓越的灵敏度和稳定性，还能解析农药降解路径，为提升农药利用效率和减少环境暴露提供了重要技术支持。
图6. 基于深度学习的智能手机分析系统。
结论
综上所述，制备了具有主-客体相互作用和空间受限环境的C60@MOF-545-Fe纳米酶，并基于其类OXD和POD活性，提出了一种无需外部能量输入的多酶驱动自级联扩增策略。随后，通过超分子相互作用将C60@MOF-545-Fe与AChE结合，进一步开发了AChE/C60@MOF-545-Fe酶-纳米酶阵列级联流动反应器，实现了多个OPs标记物的平行检测。作为概念验证，搭建了一个集成自主开发的深度学习系统和数据处理的便携式智能手机分析平台，成功地用于跟踪实际样品中OPs的降解行为。该研究不仅为酶-纳米酶系统的开发提供了通用框架，为结合深度学习的酶-纳米酶流动反应器阵列的高通量设计开辟了新的前景。
相关成果以“Enzyme-Nanozyme Cascade Flow Reactor Synergy with Deep Learning for Differentiation and Point-of-Care Testing of Multiple Organophosphorus Pesticides” 为题目发表于在国际学术期刊“Advanced Functional Materials”上。论文第一作者为济南大学博士白玉娇，通讯作者为济南大学朱沛华教授。
来源：小熊科技论
