JCB丨徐涛团队揭示新冠病毒非结构蛋白 NSP3/4/12在病毒复制细胞器形成中的核心功能机制

摘要：SARS-CoV-2 基因组编码的病毒蛋白中包含 16 种非结构蛋白 (nonstructural protein, NSP) ，它们不直接参与组成病毒颗粒，但在病毒的生命周期中发挥重要作用。冠状病毒感染宿主细胞后，通过病毒非结构蛋白NSP3和NSP4重塑宿主

SARS-CoV-2 基因组编码的病毒蛋白中包含 16 种非结构蛋白 (nonstructural protein, NSP) ，它们不直接参与组成病毒颗粒，但在病毒的生命周期中发挥重要作用。冠状病毒感染宿主细胞后，通过病毒非结构蛋白NSP3和NSP4重塑宿主细胞的内膜系统，形成DMV(double membrane vesicle, DMV) 作为病毒的复制工厂。其复制转录复合物(replication-transcription complex,RTC) 锚定在DMV上，构成复制细胞器(replication organelle,RO) ，以进行病毒基因组的转录和复制。2020年，研究人员首次发现DMV上存在膜孔复合物，并认为这些膜孔是输出DMV内病毒RNA的通道。然而，DMV及其膜孔复合物的形成机制，以及复制转录复合物如何被招募到DMV上以形成复制细胞器，目前仍未完全明确。此外，关于复制转录复合物是定位在DMV内部还是外部也存在争议。

2024 年 12 月 31 日，徐涛院士团队及其合作者在Journal of Cell Biology发表题为SARS-CoV-2 NSP3/4 control formation of replication organelle and recruitment of RNA polymerase NSP12的研究成果。研究团队结合生化、分子等实验手段，综合利用各种先进光镜和电镜成像技术，揭示了 SARS-CoV-2 非结构蛋白 NSP3/4/12 在建立复制细胞器中的核心功能机制。

首先通过冷冻光电关联成像技术证明，反式表达的NSP3和NSP4足以诱导DMV及其膜孔复合物的形成，NSP3/4是冠状病毒诱导DMV及其膜孔复合物形成的最小功能单元。进一步深入研究NSP3/4各结构域对DMV形成的影响发现，NSP3在胞浆区域的N端和C端对DMV的形成至关重要。缺失N端的NSP3与NSP4共同诱导形成的结构类似于卷曲膜（convoluted membranes），这表明在真实病毒感染宿主细胞过程中，所观察到的卷曲膜结构可能是由于缺失N端的NSP3与NSP4共同作用所致，而非领域内此前认为的DMV前体结构。相反，缺失C端的NSP3与NSP4则形成双层膜的whorl样结构（whorl-like structures）。对NSP4的C端进行研究后发现，该区域的缺失并不影响DMV的形成，但会降低DMV的数量。

研究团队进一步研究了DMV与RTC形成病毒复制细胞器的机制，系统地分析了DMV与RTC中各组分的相互作用，发现RTC中的NSP12与DMV中的NSP3存在直接相互作用。具体而言，RTC复合物通过NSP12与NSP3的N端直接相互作用，从而被招募到DMV膜外。进一步通过荧光漂白实验、APEX2标记电镜和免疫电镜都证实RTC确实定位于DMV膜外，结束了领域内的争议。然而，关于定位于DMV膜外的RTC如何将转录产物双链RNA （DsRNA）转运至DMV内部的机制，仍有待进一步研究。不过，该研究发现RTC转录形成的DsRNA产物能够影响并决定DMV的大小。

图1. NSP3/4/12控制复制细胞器形成模式图

徐涛院士课题组广州实验室李总红研究员、中科院生物物理所薛艳红正高级工程师、中科院生物物理所纪伟研究员、中科院上海感染与免疫研究所酒亚明研究员、广州海关技术中心卫生检疫研究所师永霞主任医师为该论文的共同通讯作者，博士生杨金平、田步云博士、王培博士、博士生陈榕榕为论文的共同第一作者。中科院生物物理所的孙飞研究员和朱赟研究员为该研究提供了帮助。