摘要：白内障是一种晶状体蛋白质发生异常聚集并导致晶状体混浊的眼科疾bing，是全球最常见的致盲原因之一。电子时代的迅猛发展不得不引起我们对眼睛健康的重视。目前的治~疗手段主要依赖手术切除浑浊的晶状体，但其高昂的费用及手术风险使得非手术治~疗手段的开发显得尤为重要。近

白内障是一种晶状体蛋白质发生异常聚集并导致晶状体混浊的眼科疾bing，是全球最常见的致盲原因之一。电子时代的迅猛发展不得不引起我们对眼睛健康的重视。目前的治~疗手段主要依赖手术切除浑浊的晶状体，但其高昂的费用及手术风险使得非手术治~疗手段的开发显得尤为重要。近期，浙江大学医学院附属第二医院眼科中心联合美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所（NEI）在《The Journal of Clinical Investigation》上发表了一项重要研究，发现地松鼠（GS,Ictidomys tridecemlineatus)晶状体在低温（4℃）时变得混浊，但在重新加热至37℃后迅速恢复透明，这种可逆性变化背后隐藏着一个关键分子——RNF114。RNF114（RING Finger Protein 114）是一种含有RING指结构域的E3泛素连接酶，主要参与细胞的蛋白质降解和信号传导过程。它通过将泛素分子标记到特定的靶蛋白上，调控靶蛋白的稳定性、活性或亚细胞定位，从而影响多种细胞功能。该研究首次揭示了RNF114在调控晶状体蛋白温度依赖性变化中的核心作用，为开发白内障非侵入性治~疗提供了潜在靶点。这一发现不仅刷新了我们对白内障bing理机制的理解，也有望推动全新治~疗yao物的研发，拓展了我们对白内障发bing机制理解同时，也为非手术治~疗白内障带来了新的希望。

图1

一、样本选择

GS衍生的诱导多能干细胞（GS iPSCs）构建了GS衍生诱导晶状体上皮细胞（iLEC）；人晶状体细胞（HLECs）；GSs和大鼠含有晶状体上皮细胞的晶状体囊组织鉴定蛋白组学检测

二、技术手段

* qPCR：检测iLEC模型中晶状体蛋白的表达；|TMT-定量蛋白组学技术：检测GSs和大鼠低温模型中晶状体差异蛋白；|Pull down-MS/Coip-WB：检测特定基因表达情况；|免疫荧光成像|细胞活性检测

三、研究结果

1、GS晶状体不透明在低温再温周期中被逆转

文章发现GS冬眠/昏睡时，GS晶状体变得不透明；醒来后，晶状体迅速完全恢复其透明度（图1A）。为了证实GS的独特适应性，文章比较了GS和大鼠在低温复温处理下离体晶状体的透明度。生理状态下，大鼠晶状体透明无色；GS透镜也是透明的，但颜色是淡黄色。GS和大鼠晶状体在4℃下处理24小时均出现明显的低温白内障，以中央核混浊为主。随后，在37℃下再加热约5分钟后，GS镜片的混浊现象完全消除，透过率恢复到低温处理前的水平。相比之下，大鼠晶状体保留了明显的核不透明，透过率仅恢复到86%，延长复温时间并没有进一步显著提高清晰度（图1B-D）。

图2. 地松鼠和大鼠的晶状体在低温和复温后的透明度结果

2、蛋白组学技术发现UPS促进了聚集的晶体蛋白的降解

GS衍生的诱导多能干细胞（GS iPSCs）体外诱导建立iLEC细胞模型，并通过晶状体蛋白（CRYAA/CRYAB/CRYBB2等）表达量增多来表示建模成功。

为了进一步探讨冬眠动物晶状体冷适应的具体机制，文章采用TMT蛋白组学方法对GS和大鼠含有晶状体上皮细胞的晶状体囊组织进行了检测和分析。结果发现蛋白质泛素化、泛素-蛋白连接酶活性和蛋白酶体泛素依赖的蛋白质仅在复温后的GS中显著富集（图2A）；参与泛素化蛋白降解（UPS）过程的各种E1、E2和E3酶明显上调（图2B），根据这些结果，文章推测在低温-复温周期中，GS晶状体不透明逆转的机制可能与泛素-蛋白酶体途径介导的蛋白质降解有关。之前的研究说明蛋白质是通过哺乳动物细胞的UPS或自噬降解的，文章使用这两种途径的抑制剂，观察到重新加热后突变体CRYAA（Y118D）水平的降低被蛋白酶体抑制剂MG132显著抑制；活细胞成像也显示，MG132能抑制突变体αA-晶体蛋白和αB-晶体蛋白荧光斑点的消除。这些观察结果表明，蛋白酶体的UPS对突变体αA-晶体蛋白的清除至关重要，而非溶酶体的自噬对其没有影响（图2 I-L）。

图3. 蛋白质复合物在DNA复制胁迫下有可能改变组装状态

3、RNF114在GS iLECs的低温升温过程中促进CRYAA泛素化

内源结晶蛋白的稳定性研究结果表明，在低温-复温循环中，只有CRYAA形成了显著的聚集体；CRYAB、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和γ-结晶蛋白没有明显聚集（图3A）。因此，对于内源性CRYAA，文章通过免疫荧光和共免疫沉淀（CO-IP）证实了它与泛素的相互作用（图3B-D）。在复温后，通过CO-IP观察到GS iLECs中CRYAA多泛素化水平的增加。免疫荧光进一步验证泛素与CRYAA荧光点共定位。为了确定在低温复温过程中与CRYAA相互作用的潜在E3泛素连接酶，文章使用了内源性CRYAA下拉和质谱实验，结果发现了100多个在重新加热组中特异性结合CRYAA的蛋白，其中一个被称为RNF114的蛋白已被报道具有E3泛素连接酶活性。为了进一步研究RNF114对晶状体混浊逆转的影响，文章对RNF114的mRNA水平以及互作蛋白分析，在低温复温前后进行了对比，结果发现RNF114的mRNA水平在GS iLECs中升高，这表明RNF114可能在GS晶状体的适应性调节中发挥特定作用（图3E）。Co-IP进一步证实了RNF114和CRYAA在GS iLECs复温后的相互作用（图3F-H）。RNF114的下调导致CRYAA多泛素化减少，而RNF114 WT的过表达显著促进了CRYAA（Y118D）水平的降低。后续文章构建了RNF114ΔC(1-200)，它缺乏泛素结合所需的泛素相互作用基序结构域（图3I），结果发现RNF114ΔC的引入并没有提高CRYAA的表达量（图3I-L）。结果证明了RNF114能够促进HLECs中CRYAA蛋白酶体降解。

图4. NF114在GS iLECs的低温升温过程中促进CRYAA泛素化

4、RNF114可逆转非冬眠症患~者的白内障

文章发现RNF114不影响HLECs或GS iLECs的细胞活力（图4，A和B），这从侧面反映了使用RNF114治~疗低温性白内障的安全性。为了促进RNF114向HLECs和大鼠晶状体的递送，文章将RNF114与一种细胞穿透肽TAT-(47-58)（该肽来源于HIV-1调节蛋白TAT，已被证实可用于多种系统，包括眼睛）结合，用免疫荧光图像证实TAT-RNF114在孵育30分钟后进入HLECs和离体大鼠晶状体的细胞质中（图4C）。接下来，将TAT或TAT-RNF114与GFP-CRYAA（Y118D）敲入的HLECs孵育4小时，观察到细胞质中聚集的荧光斑点逐渐减少，尤其是CRYAA(Y118D) HLECs（图4D）。随后将大鼠晶状体在4℃下孵育24小时，建立大鼠低温白内障模型，观察到TAT-RNF114处理的晶状体的混浊迅速逆转，而对照晶状体的核仍保持混浊。透镜透光率测量也验证了TAT-RNF114处理显著提高了大鼠在低温复温过程中的透镜透光效率（图4E）。另外文章用H2O2（氧化应激）诱导斑马鱼白内障，观察到TAT-RNF114治~疗12小时后晶状体混浊降低，而TAT-RNF114ΔC组和TAT对照组没有表现出这种效果，并且5只斑马鱼中有4只在晶状体混浊分类系统III （LOCS III）中至少有1级的透明度改善（图4F），表明RNF114可以缓解除寒冷以外的压力引起的晶状体混浊。

图5. RNF114治~疗低温性白内障的安全性及可逆转非冬眠症患~者的白内障

研究结论：

多种因素引起的蛋白稳态紊乱和蛋白聚集异常是白内障形成的根本bing理改变，文章通过研究地松鼠的晶状体的可逆性温度依赖性清晰度变化的机制，发现其主要依赖于复温期间UPS对CRYAA聚集体的上调，新发现的RNF114在聚集体降解和周转中起核心作用，对不同应激性白内障模型有显著可逆性影响。或许通过筛选和设计刺激特定蛋白质降解途径的yao物有助于精确调节蛋白质的稳定性和周转，从而有可能推动蛋白质稳态维持和蛋白质聚集性疾bing治~疗的进展。

参考文献：The Journal of Clinical Investigation ( IF 13.3 ) Pub Date : 2024 Sep 17 , DOI: 10.1172/jci169666

来源：科学蚂蚁新鲜事儿