摘要：近年来，单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）在揭示复杂生物系统和探索遗传学及临床研究中取得了突破性进展。然而，仅依赖单一的转录组信息往往难以区分分子相似但功能差异显著的细胞类别。因此，融合多种模态信息的单细胞测序技术逐渐成为研究热点，通过同时获取单个细胞

引言

近年来，单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）在揭示复杂生物系统和探索遗传学及临床研究中取得了突破性进展。然而，仅依赖单一的转录组信息往往难以区分分子相似但功能差异显著的细胞类别。因此，融合多种模态信息的单细胞测序技术逐渐成为研究热点，通过同时获取单个细胞的多维数据，研究人员能够更全面地解析细胞状态及其功能互作。然而，目前大多数多模态单细胞测序技术成本高昂、通量有限，难以大规模应用，尤其在临床样本分析和自动化处理方面存在诸多限制。

为了解决上述难题，1月20日Nature Methods的研究报道“UDA-seq: universal droplet microfluidics-based combinatorial indexing for massive-scale multimodal single-cell sequencing”，研究人员开发了一种基于微液滴技术的组合标记方法——UDA-seq（Universal Droplet-based combinatorial indexing for multimodal Single-cell sequencing）。这一通用性流程通过引入后索引步骤（post-indexing），显著提高了测序的通量与灵活性，并能够系统适配现有的微液滴单细胞多模态测序方法。在研究中，UDA-seq成功应用于RNA与基因组开放染色质的联合检测（RNA+ATAC）、RNA与CRISPR干扰的联合检测等多模态分析。通过对多个组织类型和细胞样本的实验验证，UDA-seq不仅能够高效生成超过10万个高质量单细胞数据，还展现出在发现稀有细胞亚群和解析复杂疾病机制方面的强大能力。

这一技术的独特之处在于，通过两轮索引标记单细胞核酸片段，既提高了数据的唯一性识别能力，又降低了实验成本，使得包括冷冻临床活检样本在内的多种样本的多模态测序成为可能。特别是在临床领域，UDA-seq成功分析了肾脏疾病相关的样本，鉴定了与蛋白尿和肾损伤相关的关键细胞亚群和调控因子。这些发现不仅揭示了疾病发生的细胞和分子机制，也为开发新的诊断和治疗方法提供了有力支持。

UDA-seq代表了一种经济高效且高度可扩展的单细胞多模态测序解决方案，为基础生物学和医学研究开辟了新的可能性。这项技术的广泛应用，有望进一步推动我们对细胞功能与疾病机制的深入理解，为精准医学的发展奠定基础。

单细胞时代的挑战与机遇

单细胞测序技术正以前所未有的速度改变我们对生物系统的理解。通过解析单个细胞的基因表达、表观遗传状态及功能特性，这一技术已成功揭示了组织内细胞多样性的本质。例如，单细胞RNA测序（scRNA-seq）在精准识别细胞类型、状态及功能上展现了无与伦比的潜力，为遗传学、发育生物学和癌症研究带来了颠覆性进展。

然而，仅仅依靠单一模态的测序技术仍有局限性。比如，单细胞转录组数据虽然能够揭示细胞间的分子差异，但对于功能上密切相关或状态过渡中的细胞类型却往往难以区分。而且，单一数据模态难以全面展示细胞内复杂的分子机制及其调控网络。例如，同一细胞中的基因表达模式和染色质可及性之间的互作，或RNA转录与蛋白功能调控的关系，都需要多模态的数据进行解析。这些问题的存在使得多模态单细胞测序技术成为当前科学研究的迫切需求。

然而，现有的多模态单细胞测序方法仍面临成本高昂、通量有限及适配性较差的困境。例如，许多方法需要为不同类型的实验设计专门的实验流程，这不仅降低了效率，还增加了实验的不确定性。特别是在临床领域，研究者常需要分析冷冻或固定样本，而现有技术对这些样本的适配性和稳定性却不足，严重限制了其实际应用。

为了应对上述挑战，研究人员开发了基于微液滴的组合标记方法——UDA-seq（Universal Droplet-based combinatorial indexing for multimodal Single-cell sequencing）。这一技术通过两轮索引标记步骤，创新性地解决了现有方法的多重限制。它不仅显著提升了单细胞测序的通量，还优化了对复杂样本的兼容性，从而为多模态单细胞数据的获取提供了新的解决方案。通过UDA-seq，研究人员能够从单一实验中同时获取RNA、染色质开放区域以及CRISPR干扰的多种信息，实现了超过10万个高质量单细胞数据的生成，并成功应用于肾脏疾病、癌症等领域的研究。

什么是UDA-seq？

UDA-seq是一种基于微液滴技术与组合标记的单细胞多模态测序方法，旨在突破传统测序技术的通量与适配性限制。其核心理念是将单细胞样本封装在微液滴中，利用两轮标记策略实现对核酸片段的精准标记。

在第一轮标记中，单细胞或细胞核通过微液滴技术被分装到含有条形码的液滴中，条形码充当细胞的“身份证”，为每个液滴内的核酸分子提供唯一标识。接着，液滴中的细胞核被释放并与其他液滴样本混合后进行第二轮标记。这一步采用96或384孔板的孔位条形码，再次为每个核酸分子添加独特标记。通过这两轮标记，UDA-seq不仅能够确保核酸分子的唯一性标记，还显著提高了条形码组合的多样性，理论上可生成960万至3800万种组合。

这种设计的另一个优点在于可以显著降低数据冲突率。在实际实验中，单细胞数据冲突率仅为1.23%（传统单轮索引标记方法为6.29%），证明其在解析单细胞核酸片段时的高精确性和低误差率。

UDA-seq的技术特点：高通量、低成本与灵活性

UDA-seq的显著优势之一是其高通量能力。在实验中，研究人员通过加载50万个细胞，生成了超过10万个高质量单细胞数据，显著优于许多现有方法。此外，UDA-seq具备高度的样本兼容性，可以处理包括冷冻组织、固定细胞在内的多种样本类型，充分展现了其在临床和科研中的广泛适用性。

此外，成本也是显著降低。传统多模态单细胞测序技术往往成本高昂，而UDA-seq通过优化流程和提高数据利用率，实现了每个样本15至20倍的成本下降。更重要的是，这种技术对现有设备要求较低，无需额外的硬件配置，使得许多实验室都能轻松实现升级应用。

如何验证UDA-seq的能力？

物种混合实验：解析细胞特异性

验证UDA-seq能力的重要一步是通过物种混合实验（species-mixing experiments），评估其对不同细胞来源的精准解析能力。研究人员选用了人类HeLa细胞和小鼠NIH 3T3细胞进行混合实验，这是单细胞测序中常用的技术验证手段。通过这种方法，可以测试测序系统区分不同物种细胞的准确性。

实验结果显示，UDA-seq能够成功识别99.1%的人类和小鼠细胞，其数据解析的高精确性远超传统方法。这种分辨能力得益于UDA-seq的两轮索引策略，其确保了每个单细胞片段都带有独特的双重条形码，从而避免了数据冲突。更重要的是，实验中几乎未观察到跨物种的假阳性结果，这进一步证明了UDA-seq在处理复杂混合样本时的优越性。

与现有方法的对比分析：低冲突率与高数据保真度

UDA-seq在多模态测序领域的突破还体现于其与现有技术的对比中。一个显著的优势是其低冲突率（collision rate），即多个细胞核酸片段误标为同一来源的比例。在传统单轮索引标记方法中，冲突率通常高达6.29%，这严重影响了数据质量。而UDA-seq通过双重索引标记，将这一比例降至1.23%，大幅提高了数据保真度。

除了冲突率的降低，UDA-seq还在多模态数据整合的质量上表现出色。以RNA和ATAC（染色质开放性）联合分析为例，UDA-seq生成的多模态数据在解析基因表达与染色质状态的相关性方面展现了更高的分辨率。这为进一步探索基因调控网络提供了新的技术支撑，也为基因表达与表观遗传机制的联合研究开辟了新途径。

冷冻样本中的挑战与解决方案

单细胞测序技术在处理冷冻样本时通常面临样本降解和数据质量下降的挑战。然而，UDA-seq通过优化实验流程，成功突破了这一限制。在实验中，研究人员选用了肾脏活检样本进行测试。这类样本由于细胞状态的不稳定性和复杂性，一直是单细胞测序技术的瓶颈。

实验结果表明，UDA-seq能够在冷冻样本中实现高质量的单细胞多模态数据生成。例如，在肾脏样本的RNA与ATAC联合分析中，研究人员不仅成功鉴定出与肾功能相关的关键基因表达模式，还发现了一些与蛋白尿和肾损伤相关的稀有细胞群体。这些发现为理解肾脏疾病的细胞与分子机制提供了宝贵线索。

值得注意的是，UDA-seq的适配性使其能够处理多种冷冻样本，包括癌症活检和神经组织。这一特性极大地拓展了单细胞多模态测序的应用范围，尤其在需要分析保存样本的临床研究中表现出巨大的潜力。

UDA-seq的工作流程及其在多模态和多样本分析中的表现（Credit:Nature Methods）

a. UDA-seq的工作流程

UDA-seq的实验流程，包括两轮条形码标记（barcoding）。第一轮标记通过微液滴技术为每个单细胞分配唯一条形码，随后经过细胞混合后进行第二轮标记，这一步通过孔板条形码进一步为核酸片段添加唯一标识。两轮索引策略确保了数据的高通量和高保真度。

b–d. 物种混合实验的结果

物种混合实验用来验证UDA-seq在不同条件下的性能：

b. 单细胞3′-RNA测序：采用96孔板进行后索引。实验表明，UDA-seq能够精确区分人类和小鼠细胞，具有高精度的物种特异性解析能力。

c. 单细胞核3′-RNA测序：通过16孔板后索引实现，进一步展示了在更复杂样本中的稳定性。

d. 单细胞核多模态测序（scMultiome）：利用16孔板后索引同时获取RNA和ATAC数据，证明了UDA-seq在多模态整合分析中的优越性能。

e, f. 基因和峰值信号的检测能力比较

e. RNA与ATAC数据的对比：通过小提琴图显示，UDA-seq的scMultiome数据与10x Genomics相比，能够检测到更多的基因（RNA）和染色质开放性峰值（ATAC）。中位数显示，UDA-seq在基因和峰值检测数量上明显优于对照方法。

f. sc5′-RNA测序：同样的对比分析显示，UDA-seq在基因检测范围和数据质量上显著优于10x Genomics，特别是在检测稀有表达基因方面表现突出。

g. UDA-seq与10x Genomics在免疫受体库分析中的比较

在免疫受体（T细胞受体和B细胞受体）检测中，UDA-seq的表现超过10x Genomics：使用Next GEM（Kit_v2）和GEM-X（Kit_v3）的UDA-seq能够检测到更高比例的T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）。这一结果表明，UDA-seq在免疫系统分析中具有更高的灵敏度和数据深度。

h. 超高通量单细胞RNA测序

UDA-seq还展示了在超高通量分析中的潜力：单个实验中对超过15万个细胞进行了5′-RNA测序，并通过UMAP聚类分析鉴定出44种不同的细胞类型。这些细胞类型在UMAP图上以不同颜色标识，展现了其卓越的分辨率。

j. 稀有细胞类型的鉴定

通过UDA-seq技术，研究人员成功识别出多个稀有细胞类型，并通过标签清晰标注。这一能力特别适用于解析组织中的细胞异质性，以及在疾病研究中发现关键的稀有细胞群体。

多模态联合测序的突破

多模态测序的核心价值在于同时揭示不同层次的分子信息，为深入解析复杂的生物学机制提供了全新视角。UDA-seq的技术设计极大地扩展了多模态分析的可能性，其灵活性和通用性使得研究人员能够从单一实验中同时获取多种数据类型。

RNA与开放染色质（ATAC）的联合分析

转录组（RNA）和染色质开放性（ATAC）是揭示基因调控网络的关键。RNA测序可以提供基因表达的直接信息，而ATAC-seq则揭示基因表达背后的表观遗传调控。通过UDA-seq的多模态联合分析，研究人员能够在单细胞水平同时获取这些信息，从而直接关联基因表达与其调控区域的状态。

在实验中，研究人员利用UDA-seq对不同类型组织进行了RNA+ATAC联合分析，发现这种方法能够精确定位细胞类型特异性的染色质开放区域，并揭示与基因表达直接相关的调控因子。例如，在免疫细胞研究中，UDA-seq帮助发现了T细胞中染色质开放性与特定细胞状态（如活化或抑制）之间的关联。这一发现为解析免疫系统的动态调控机制提供了有力工具，同时也为免疫疾病的靶点研究开辟了新的路径。

RNA与免疫受体库（VDJ）的联合分析

免疫受体（如T细胞受体和B细胞受体）的多样性是免疫系统识别和对抗病原体的基础。传统的免疫受体测序技术通常与转录组分析分离进行，难以关联单个细胞的免疫受体谱系与其功能状态。UDA-seq通过结合RNA测序与VDJ重组分析，使得单细胞水平的全面免疫研究成为可能。

在验证实验中，研究人员利用UDA-seq对来自健康个体和衰老个体的外周血单核细胞（PBMC）进行了分析。结果显示，该技术能够同时解析T细胞和B细胞的受体序列，并将其与细胞的转录状态直接关联。例如，研究揭示了衰老个体中B细胞受体多样性的下降，同时伴随着炎症相关基因的表达上调。这一发现不仅加深了对衰老免疫系统特征的理解，也为开发新型免疫治疗提供了重要线索。

RNA与CRISPR干扰的联合分析

CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）技术是一种高效的基因调控工具，能够通过抑制目标基因的表达，研究其功能。然而，传统CRISPR筛选方法通常在细胞群体水平上进行，无法解析单细胞层面的异质性。UDA-seq将RNA测序与CRISPRi筛选结合，使研究人员能够在单细胞水平评估基因干扰的效果。

在针对肾脏疾病的实验中，研究人员通过UDA-seq分析CRISPRi对肾小管细胞的基因调控作用。结果发现，干扰特定的转录因子基因能够显著改变肾小管细胞的转录模式，并诱导细胞进入特定的应激状态。这些发现为进一步探索肾脏病理机制提供了重要信息，同时也证明了UDA-seq在基因功能研究中的巨大潜力。

稀有细胞亚群的发现

肾脏疾病研究中的关键细胞群体鉴定

肾脏疾病的研究长期以来面临着细胞异质性高、稀有细胞难以检测的挑战。UDA-seq的出现为解决这一问题提供了新的技术支持，通过高通量和高精度的单细胞多模态测序方法，研究人员成功鉴定了与肾脏疾病密切相关的关键细胞亚群，为疾病的诊断和治疗开辟了新途径。

在针对肾脏活检样本的研究中，研究人员利用UDA-seq对肾脏不同区域的单细胞进行了分析。这些样本包含了健康对照和多种病理状态，包括蛋白尿和急性肾损伤（AKI）。通过多模态测序，研究团队不仅解析了肾脏细胞的主要组成，还在病变区域中发现了几个关键的稀有细胞亚群。例如，在急性肾损伤样本中，UDA-seq检测到一种独特的肾小管细胞亚群，这些细胞表现出明显的应激反应基因上调以及炎症信号的激活。

这种稀有细胞的存在在传统方法中难以被识别，但通过UDA-seq，研究者能够精确量化其分布比例，并进一步揭示其在疾病进展中的潜在作用。

与蛋白尿及肾功能受损相关的分子机制

蛋白尿是多种肾脏疾病的重要症状之一，其背后隐藏着复杂的细胞和分子机制。通过UDA-seq，研究人员对肾脏蛋白尿样本中的单细胞进行了深入的分子特征分析，并成功解锁了一些关键机制。

研究显示，在蛋白尿患者的肾小球区域，UDA-seq鉴定出一种高表达炎症相关基因的稀有巨噬细胞亚群。这些细胞不仅释放促炎细胞因子，还与肾小球基底膜损伤高度相关。同时，在肾小管区域，研究发现一种代谢异常的上皮细胞亚群，这些细胞呈现出显著的线粒体功能失调和氧化应激反应。这些异常的细胞活动模式为蛋白尿的发生和发展提供了新的解释。

此外，UDA-seq揭示了蛋白尿样本中一些关键转录因子的表达变化。例如，研究发现HNF1B和NRF2在蛋白尿患者样本中的表达显著下降，这可能是肾小管上皮细胞失去屏障功能的重要原因。这些结果进一步支持了蛋白尿的分子机制不仅涉及局部炎症反应，还包含复杂的代谢和转录调控网络。

免疫系统老化的细胞学特征

人体衰老与T细胞、B细胞的动态变化

随着年龄增长，人体免疫系统逐渐发生功能衰退，这一现象被称为“免疫衰老”。UDA-seq通过单细胞多模态测序技术，为免疫系统在衰老过程中的细胞学变化提供了全新视角。

研究人员利用UDA-seq对来自年轻个体和衰老个体的外周血单核细胞（PBMC）进行了系统分析。结果显示，与年轻人相比，衰老个体的T细胞和B细胞群体发生了显著的数量和功能变化。其中，效应性T细胞（effector T cells）的比例显著上升，而初始T细胞（naïve T cells）显著减少。这一变化反映了免疫系统逐渐向记忆性状态转变，但同时也伴随着免疫应答能力的下降。

对于B细胞，衰老个体中未成熟B细胞和记忆B细胞的比例发生了动态变化，呈现出炎症相关基因的高表达特征。这表明，在衰老免疫系统中，B细胞不仅参与抗体生成，还可能参与慢性炎症的维持，这与衰老相关的多种疾病密切相关。

此外，UDA-seq还揭示了一些与衰老相关的关键分子变化。例如，FOXP1基因在初始T细胞中的表达显著降低，而CXCL13在记忆B细胞中的表达上调。这些分子标志物为深入研究免疫衰老的分子机制提供了重要线索。

γδT细胞与自然杀伤细胞的关键作用

γδT细胞和自然杀伤（NK）细胞是免疫系统中两类重要的先天性免疫细胞，在维持免疫监视和抗病原体功能中扮演关键角色。通过UDA-seq的分析，研究人员发现，衰老对这两类细胞的功能和数量产生了显著影响。

在γδT细胞中，衰老个体表现出显著的功能多样性下降。一些亚群的γδT细胞失去了分泌促炎性细胞因子的能力，而另一些亚群则表现出过度的炎症反应，这种不平衡可能是衰老过程中免疫功能紊乱的表现。此外，研究发现，γδT细胞中与代谢相关的基因（如PPARγ和SIRT1）表达显著下降，这表明代谢功能的衰退可能是其活性降低的重要原因。

对于自然杀伤细胞，衰老个体中其总数量显著减少，同时一些关键功能基因（如GZMB和PRF1）的表达下降，导致NK细胞的杀伤能力受损。更重要的是，UDA-seq揭示了衰老NK细胞中染色质开放状态的变化，暗示其基因表达调控机制发生了深刻的改变。

有趣的是，尽管总体功能受损，一些NK细胞亚群在衰老个体中却表现出增强的分泌功能，可能与慢性炎症的维持有关。这一发现为理解衰老相关的慢性疾病提供了新的研究视角。

多模态测序的蓝图

作为一种突破性的单细胞多模态测序技术，UDA-seq正在从根本上改变基础生物学和精准医学的研究方式。在基础研究中，UDA-seq为探索复杂生物系统中的细胞异质性、稀有细胞群体及分子调控网络提供了前所未有的工具。例如，通过在肾脏疾病、免疫衰老等领域的应用，UDA-seq已证明其在发现关键细胞亚群和揭示基因调控机制方面的独特优势。

此外，精准医学的核心目标是实现个性化的疾病诊断与治疗，而这需要对患者样本进行全面且高分辨率的分子解析。UDA-seq的多模态特性使其能够同时获取转录组、表观遗传信息和基因干扰数据，从而构建更加完整的分子图谱。这种能力对于癌症、神经退行性疾病及免疫相关疾病的研究尤为重要。随着临床样本适配性的不断优化，UDA-seq有望成为精准医学的重要工具，帮助研究人员识别个体化治疗的最佳靶点并评估治疗效果。

单细胞技术发展的下一步：从单细胞到细胞网络的解读

尽管单细胞测序技术已经能够深入解析单个细胞的分子特征，但生命现象往往依赖于细胞之间的相互作用和网络关系。因此，单细胞技术的下一步发展方向是从解析单细胞扩展到构建细胞网络，这对于理解组织内的细胞通讯和系统调控尤为重要。

UDA-seq的多模态特性为这一方向提供了技术支持。例如，在免疫系统研究中，研究人员可以利用UDA-seq同时解析T细胞的转录状态和其与其他细胞的相互作用。通过构建细胞通讯网络，揭示炎症或疾病状态下的信号传递路径。未来，结合空间转录组学，UDA-seq或可帮助研究人员在空间维度上进一步精确定位这些相互作用，为构建动态的细胞网络模型提供更多数据支持。

此外，UDA-seq在稀有细胞群体的发现和功能研究中的表现，为理解组织修复、发育和疾病进程中的细胞协同作用提供了新思路。这种从单细胞到细胞网络的跨越性进展，代表了单细胞测序技术发展的新高度。

多模态大数据与人工智能的结合

随着多模态测序技术的普及，科学研究将产生海量的单细胞数据。这些数据包含转录组、表观遗传组及功能组等多个维度的信息，如何整合和解析这些复杂数据，成为未来的一大挑战。而人工智能（AI）的引入，为多模态数据的深度解析提供了可能。

UDA-seq生成的大量高质量数据为机器学习和深度学习算法提供了理想的训练数据集。例如，AI算法可以被用于识别不同疾病状态下的特定细胞亚群模式，预测关键基因调控网络，甚至为药物靶点筛选提供辅助支持。同时，AI技术还可以自动化处理UDA-seq数据中可能存在的技术噪声，提高分析的准确性和效率。

更重要的是，AI与UDA-seq的结合不仅局限于数据分析，还可以用于结果的可视化和实验设计的优化。例如，AI算法可以根据现有数据模型预测实验参数，为研究人员提供更高效的实验方案。这种结合将大幅提高研究效率，并推动技术在实际应用中的落地。

UDA-seq不仅开创了单细胞多模态测序的新时代，也为基础研究和精准医学的发展提供了强大的技术支撑。未来，随着单细胞技术向细胞网络解析的深入发展，以及多模态数据与人工智能的深度结合，UDA-seq有望成为更多领域的核心工具，推动生命科学研究迈向一个更加全面和精准的阶段。

参考文献

Li Y, Huang Z, Xu L, Fan Y, Ping J, Li G, Chen Y, Yu C, Wang Q, Song T, Lin T, Liu M, Xu Y, Ai N, Meng X, Qiao Q, Ji H, Qin Z, Jin S, Jiang N, Wang M, Shu S, Zhang F, Zhang W, Liu GH, Chen L, Jiang L. UDA-seq: universal droplet microfluidics-based combinatorial indexing for massive-scale multimodal single-cell sequencing. Nat Methods. 2025 Jan 20. doi: 10.1038/s41592-024-02586-y. Epub ahead of print. PMID: 39833568.

责编|探索君

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