摘要：靶向蛋白降解（TPD）作为一种新兴治疗策略，近些年取得了令人瞩目的发展，尤其是蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）技术，更是代表着TPD的前沿，当前超过20种PROTACs处于临床研究阶段。

DOI: 10.1002/med.22101

靶向蛋白降解（TPD）作为一种新兴治疗策略，近些年取得了令人瞩目的发展，尤其是蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）技术，更是代表着TPD的前沿，当前超过20种PROTACs处于临床研究阶段。

然而，传统的PROTACs面临挑战，诸如有限的结合亲和力、促进感兴趣靶标（POI）降解的E3连接酶配体可及性有限等。共价药物有可能通过靶向以前认为“不可成药”的浅结合位点来提高PROTACs的疗效。对于特定的靶标，如KRAS、BTK、EGFR、以及E3连接酶如DCAF16、Keap1等，改变策略，可以建立与PROTACs分子的共价连接。

共价降解的概念被用于各种新兴形式的降解剂，如共价分子胶、细胞内点击形成的蛋白水解靶向嵌合体（CLIPTAC）、HaloPROTAC、溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）和GlueTAC。

本周（Jan. 21)，郑州大学药学院及其第一附属医院在Med Res. Rev.上刊载了重要汇总，讲述了共价PROTACs以外的共价降解剂最新进展，并探讨了该领域相关的障碍和未来发展方向。

01

靶向降解剂的发展

细胞内蛋白通过泛素依赖性水解降解是维持细胞健康的关键过程。这个过程包括蛋白酶体分解蛋白质的三个步骤：

首先，泛素（Ub）被泛素激活酶（E1）激活；

然后，通过反式巯基化反应转移到泛素偶联酶（E2）上；

随后，泛素蛋白酶（E3）将与E2结合的泛素转移到POI上，将POI的赖氨酸残基连接到泛素的羧基末端，形成泛素蛋白复合物；

最终，多泛素化底物蛋白被26S蛋白酶体复合物识别并降解。

PROTACs由三个部分组成：一个吸引E3连接酶的配体，一个与POI结合的弹头，以及一个连接它们的合适的连接体，如下图是PROTAC介导的POI降解机制。PROTAC通过使POI接近合适的E3连接酶，促进POI的泛素化及其随后通过泛素-蛋白酶体系统的降解。POI降解完成后，解离的PROTAC进入下一个催化循环。

PROTACs相比抑制剂有许多好处，包括事件驱动机制，使它们能够结合到靶蛋白上不同位点进行降解，扩大了潜在靶标的范围；此外，PROTACs的催化性质允许以最小的剂量和频率保持有效和持久的药物作用，潜在地克服对传统药物的耐药性。

E3连接酶对于识别和确定UPS中底物的特异性至关重要。尽管有超过600种蛋白因子靶向与UPS介导的降解，但当前大多数PROTACs将POI定向到少数E3连接酶上。

当前最常用的E3连接酶是CRBN和VHL，其次是凋亡蛋白抑制剂（IAP）和MDM2。此外，虽然使用最为频繁，但CRBN、VHL在靶向蛋白降解中表现出明显而有限的底物特异性。

因此，发现新型E3连接酶配体有望拓宽TPD的潜在应用。

研究发现，约97%的人类E3连接酶具有易被亲电探针修饰的Cys，这表明很大一部分E3连接酶可能通过共价配体策略被纳入PROTAC可靶向目录。共价E3连接酶配体的发现可以扩大基于PROTAC的药物发现和应用于重要生物学问题的能力。

除了PROTACs，其它UPS介导的蛋白质降解如分子胶（MGs），也得到了发展。分子胶相比于PROTACs一般分子量较小，从外观上看没有显著的连接器，也因此提高了口服生物利用度、增强了细胞渗透性。然而，分子胶一般都是基于偶然发现，缺乏系统的评估标准和合理的设计策略，因此，影响了分子胶发现与应用的效率。

CLIPTACs是通过四嗪标记的沙利度胺衍生物（Tz-Thalidomide），和反式环辛烯（TCO）标记的配体之间，在细胞内快速地发生点击化学反应形成的。这种进入细胞后原位组装的方式，相比于PROTACs，使CLIPTACs能够克服与细胞渗透性、运输和给药相关的障碍。唯一担心的问题是：生物正交化学反应可能发生在细胞外，影响高分子量的CLIPTACs进入细胞。

PHOTACs，光化学靶向嵌合体，无光时无活性，UV激活后可选择性地降解POI。这种方法在时间和空间尺度上改善了对POI降解的调节，潜在地减少了有害副反应。然然，UV可能造成遗传伤害，同时也无法深入人体。

此外，基于溶酶体酶的降解技术也在发展。

如溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）、自噬靶向嵌合体（AUTAC）、自噬体束缚化合物（ATTEC）等。

LYTAC是一种杂交分子，附着在细胞表明的POI和溶酶体靶向受体（LTR）的胞外结构域上，导致蛋白质降解。因此，这种方法用于降解细胞外和膜上的蛋白质，但这一过程通常需要几天时间，并且依赖抗体来维持有效性。同时在确定连接组件的最佳位置时也存在挑战。

AUTAC触发K63多泛素化，这是自噬途径特异性检测到，导致POI降解。然而，这个确切的过程尚未可知。

ATTEC分子通过与POI和必需的自噬蛋白LC3相互作用，促进POI和自噬细胞之间的连接。这类分子具有药理特性和优势以及广泛的潜在靶点，然而这类分子的发现很有挑战性，很大程度上依赖于劳力和广泛筛选。

当前，有超过23种PROTACs、18种分子胶降解剂和1种Hyt降解剂已经进入临床试验阶段。通过特异性靶向激酶、蛋白偶联受体、表观遗传蛋白和转录因子、用于治疗各种癌症和其它疾病，详见如下表格。

大多数PROTACs与POI形成可逆的非共价相互租用，可能导致较弱的结合亲和力、和脱靶效应。共价PROTACs可以靶向难以与非共价配体结合的POI，拓宽PROTACs的潜在应用。

对于共价PROTACs可以分为可逆或不可逆共价两种形式，此外，共价弹头可以分别靶向POI或靶向E3连接酶形成共价键来起作用。因此，共价PROTACs可以分为以下4种形式。

不可逆共价PROTAC简化了传统PROTAC介导降解所需络合物的形式，从三元复合物转变为二元复合物，从而提高了降解效率。可逆共价PROTACs具有双重功能，既是POI的高亲和结合剂，又是POI降解的有效催化剂，同时具有抑制剂和降解剂的作用。

02

共价POI配体的PROTACs

BTK是一种非受体蛋白激酶，存在于除T细胞外的所有造血细胞中，包括5个结构域：PH、TH、SH3、SH2、SH1。

研究表明许多癌症、免疫系统疾病和炎症的发病机制与BTK的过表达有关。已有多种非共价PROTACs报道，引起BTK降解，有效克服BTK抑制剂的耐药性。然而，这类分子仍然存在生物活性障碍问题，因此，基于BTK的共价PROTACs也被开发出来。

如下图，是开发的一系列共价靶向POI配体的PROTACs，紫色标注了共价弹头。

表皮生长因子受体（EGFR）是一种酪氨酸激酶受体，在调节细胞生长、分化、分裂、存活和癌症的发生发展中起着重要作用。它在胶质瘤、肾癌、肺癌等多种实体瘤中经常被观察到过表达或异常表达。

下图中是一些报道的针对EGFR开发的靶向共价靶向POI的PROTACs。

KRAS是最常见的一类传统“不可成药”靶标，其中KRASG12C突变体包含一个Cys残基可被共价抑制剂靶向。共价抑制剂在治疗该突变体引起的癌症方面表现出了潜力，然而，它们的有效性受到适应性耐药性的阻碍。因此，有必要开发新的治疗方式。

以下是近些年开发的，共价靶向KRASG12C的PROTACs。

ERK1和ERK2是细胞外有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK），负责控制许多细胞反应。这些激酶在多种不同类型的癌症中过度激活，如黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌等。

当前开发的主要抑制剂缺乏选择性，因此需要开发新的策略消除副作用并加强疗效。如下图，是针对ERK1/2开发的CLPROTAC。

03

共价E3配体的PROTACs

除了共价靶向POI设计的PROTACs，也有报道针对E3连接酶设计共价配体，进而开发为共价PROTACs。

涉及的E3连接酶包括DCAF16、RNF4/114/126、Keap1、FEM1B、CRBN、VHL、DDB1等。

04

共价分子胶

分子胶通过促进或加强E3连接酶与POI之间的蛋白质相互作用（PPIs），从而增强泛素化过程和随后的蛋白酶体对POI的降解，如下图。

分子胶优点包括分子量低、靶向具有挑战性的靶标。然而，大多数分子胶都是偶然发现的，缺乏合理的发现途径。共价分子胶的设计为分子胶的探索和鉴定提供了新的方向。

如下是一些针对共价弹头设计的分子胶靶向降解剂。

共价分子胶降解剂通过靶蛋白与E3链激酶的共价附着促进蛋白质降解。这种方法有几个优点：选择性增加、适用于传统上难以靶向的蛋白质、减少药物剂量、高效的蛋白质降解效率。

然而，共价分子胶也有相关缺陷：如和共价药物同样存在的脱靶毒性问题、药物设计中的挑战性问题等。

05

Halo PROTAC

由于POI靶向需要精确的小分子配体，目前PROTACs对绝大多数内源性蛋白的有效性受到限制。因此，通过CRISPR/Cas9基因编辑，结合多肽标签靶向基序，如Halo标签，开发了Halo PROTACs，作为降解细胞质和核内体Halo标签融合蛋白的策略。

Halo PROTACs的作用机制如下图：Halo PROTACs结合E3连接酶，并于融合到POI上的Halo标签共价作用，促进它们被招募到E3复合体进行泛素化，以及随后的蛋白酶体依赖性降解。

相关Halo PROTACs报道实例如下图。

Halo PROTAC利用Halo标签系统快速和不可逆结合氯烷烃标记化合物的能力，从而促进Halo标签融合蛋白的降解，并在提高效力和选择性方面提供好处。

然而，Halo PROTAC的应用却决于Halo标签融合蛋白的表达，因此限制了其在转基因细胞中的应用。此外，Halo PROTAC仅限于降解Halo 标签融合蛋白，也限制了靶标范围。

06

其它共价降解剂

靶向溶酶体嵌合体（LYTACs)的出现，代表着对细胞外蛋白和膜蛋白降解领域的一大进步。

LYTACs是一类双功能分子，主要由两部分组成：一端是抗体、多肽、或小分子，可以靶向细胞外蛋白或膜蛋白的细胞外结构域；另一端是糖肽配体，可以结合细胞表面溶酶体靶向受体（LTRs），其作用机制如下图A。

如上图B，是通过生物正交反应修饰嵌合体适配体与叠氮化合物标记的PD-L1,使PD-L1在肿瘤细胞表面有效降解。

共价选择性雌激素受体降解剂（cSERDs）是一类共价靶向ERα的小分子降解剂，如下图。

通过与ERα形成独特的拮抗剂构象，最终促进POI降解。

如下图，GlueTACs是一类基于共价纳米抗体的PROTACs策略，利用纳米抗体与癌细胞表面抗原共价结合，促进膜蛋白的降解。

这种方法设计纳米抗体与细胞穿透肽和溶酶体分选序列（CPP-LSS）结合，以增加结合亲和力，并通过化合价驱动的相互作用以减少脱靶效应，从而促进共价纳米抗体复合物的有效内化和溶酶体降解。

GluTAC通过有效降低PD-L1水平和抑制肿瘤生长表现出高效率，超过了FDA批准的PD-L1抗体的性能。个体化筛选以及确定非天然氨基酸整合和修饰位点对GlueTAC的广泛应用构成潜在的限制。

来源：营养和医学