摘要：香连丸（XLP）是一种广泛用于治疗溃疡性结肠炎（UC）的中药。然而，其在UC中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨XLP治疗UC的作用机制以及M1巨噬细胞极化在这一过程中的作用，使用UC小鼠进行体内实验，选择RAW264.7细胞进行体外实验。3%葡聚糖硫酸钠诱导

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导读

香连丸（XLP）是一种广泛用于治疗溃疡性结肠炎（UC）的中药。然而，其在UC中的作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨XLP治疗UC的作用机制以及M1巨噬细胞极化在这一过程中的作用，使用UC小鼠进行体内实验，选择RAW264.7细胞进行体外实验。3%葡聚糖硫酸钠诱导UC小鼠模型，评估组织病理学和促炎细胞因子的变化；流式细胞术检测肠系膜淋巴结中M1巨噬细胞的水平；使用能量代谢组学分析法分析结肠代谢物水平。免疫荧光染色用于测量TNF-α、IL-6和iNOS的表达水平，而qRT-PCR用于定量TET2、STAT1和Nfkbiz的mRNA水平。结果表明XLP减轻了溃疡性损伤，降低了结肠中TNF-α和IL-6的水平，还下调了M1巨噬细胞的水平，调节了能量代谢状态。具体而言，XLP显著增加了结肠组织中的衣康酸（ITA）水平，这种增加与XLP处理后M1巨噬细胞水平降低和UC缓解显著相关。此外，ITA直接抑制了巨噬细胞从M0表型到M1表型的极化，同时伴有TNF-α、IL-6和iNOS水平的降低。并且ITA通过抑制TET2/STAT1和TET2/NF-κB信号通路降低了M1巨噬细胞的炎症反应。因此，XLP可以通过增加能量代谢产物ITA的水平来抑制M1巨噬细胞极化，从而治疗UC。

亮点：

1.香连丸对溃疡性结肠炎（UC）小鼠的治疗作用是通过抑制M1巨噬细胞极化来实现的。

2.XLP对UC治疗中M1巨噬细胞极化的抑制作用与能量代谢产物衣康酸的增加有关。

4.衣康酸水平增加通过抑制TET2/STAT1和TET2/NF-κB通路来改善XLP对极化M1巨噬细胞炎症反应的抑制作用。

论文ID

原名：Xianglian pill alleviates ulcerative colitis by inhibiting M1 macrophage polarization via modulation of energy metabolite itaconate

译名：香连丸通过调节能量代谢物衣康酸抑制M1巨噬细胞极化，减轻溃疡性结肠炎

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.10

通讯作者：刘昌顺

通讯作者单位：南方医科大学

实验设计

实验结果

1. XLP减轻UC小鼠结肠损伤和炎症

XLP粉末样品的水提取物的收率为24.5±1.9%。我们使用HPLC对XLP组分进行表征。测试样品中XLP成分指纹图谱的重复性良好（图1A）。鉴定的化学成分包括药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱、木香烃内酯和去氢木香内酯（图1B）（分别为2.41±0.01、18.68±0.04、8.03±0.09、41.84±0.11、1.88±0.01和2.85±0.03 mg/g生药）。这些化合物可能是参与UC治疗的XLP的生物活性成分。

图1 XLP的成分测定及其对UC的影响。（A）成分指纹。（B）根据标准品鉴定成分。（C）研究的流程图。（D）重量变化。（E）结肠的长度。（F） DAI评分。（G）结肠H&E染色。（H）结肠组织中TNF-α和（I）IL-6的浓度。数据以平均值±标准差的形式呈现。采用单因素方差分析（ANOVA）结合Bonferroni检验进行统计分析，并对多重比较进行Bonferoni校正。（F）代表通过Kruskal-Wallis单因素方差分析结合Dunn事后检验、Bonferroni多重比较校正分析的个体小鼠。与正常组相比，*P

此外，研究流程图如图1C所示。结果显示，XLP逆转了UC小鼠体重的下降（图1D）。XLP还降低了DAI评分，并剂量依赖性地增加了UC小鼠的结肠长度（图1E-F）。组织病理学分析显示，DSS诱导后，肠绒毛组织受损，炎性细胞浸润到结肠黏膜中，而XLP和5-ASA逆转了这些变化（图1G）。此外，与DSS组相比，XLP剂量依赖性地显著降低了结肠组织匀浆中的TNF-α和IL-6水平（图1H-I）。这些结果表明，XLP和5-ASA对UC的疗效相似，表明治疗效果良好。

2. XLP抑制UC小鼠M1巨噬细胞极化

黏膜组织损伤导致病原体入侵和巨噬细胞浸润，尤其是极化M1巨噬细胞的浸润。这促进了促炎细胞因子的分泌，最终诱导UC。数据发现，DSS组MLN中F4/80+CD11c+巨噬细胞的百分比高于正常组。然而，XLP剂量依赖性地逆转了这些变化（图2A）。此外，为了进一步区分结肠组织中的M1巨噬细胞，我们对F4/80和CD11c标记物进行了共染色。该分析表明，XLP显著降低了UC小鼠中F4/80和CD11c的表达（图2B）。根据这些结果，XLP抑制M1巨噬细胞极化治疗UC。

图2 XLP对UC小鼠M1巨噬细胞水平的影响。（A）代表性流式细胞术图。XLP剂量依赖性地降低了MLN中F4/80+CD11c+巨噬细胞的水平。（B）结肠组织中F4/80和CD11c的表达水平（n=4）。数据以平均值±标准差表示。采用Bonferroni检验的单因素方差分析进行统计分析，多重比较采用Bonferoni校正。显著性水平表示为*P

3. XLP逆转UC小鼠结肠组织的代谢重编程

代谢重编程参与M1巨噬细胞极化的诱导。我们推测XLP可能通过调节代谢重编程来抑制UC小鼠M1巨噬细胞极化。在此，结果表明，代谢特征可以在正常和UC状态之间进行区分。然而，XLP将DSS组的代谢状态改变为正常组（图3A）。基于组织浓度，有40种能量代谢物的水平显示为热图（图3B）。此外，XLP显著降低了乳酸水平，增加了ATP水平，表明能量代谢得到改善。KEGG富集分析表明，XLP处理改变了结肠组织的代谢途径。XLP还影响代谢重编程相关途径，包括柠檬酸循环、氧化磷酸化和糖酵解（图3C）。此外，差异代谢物分析显示，XLP主要下调柠檬酸盐、顺式乌头酸盐和异柠檬酸盐的水平，并增加衣康酸（ITA）、Ga3P和α-酮戊二酸的水平（P

图3 XLP对结肠组织中能量代谢物水平的影响（n=6）。（A）PCoA分析。（B）测试代谢物的热图展示。（C）KEGG分析。（D）柠檬酸盐、（E）顺式乌头酸酯、（F）异柠檬酸酯、（G）衣康酸、（H）Ga3P和（I）α-酮戊二酸的代谢物水平。（J）XLP处理对代谢特征的影响。数据以平均值±标准差表示。采用Bonferroni检验的单因素方差分析进行统计分析，多重比较采用Bonferoni校正。显著性水平表示为*P

4. 转录组学显示XLP对结肠组织代谢重编程的调节作用

由于XLP似乎可以调节结肠组织中的能量代谢，我们研究了它对能量代谢相关酶表达的潜在影响。转录组学分析显示，DSS显著改变了基因表达，1655个基因上调，1028个基因下调（图4A），而XLP分别上调和下调1216和1295个基因（图4B）。维恩图显示，XLP干预前后共有1795个差异基因（图4C）。此外，KEGG富集分析确定，在前20条通路中，XLP干预前后有9条共同通路（图4D-E）。这些途径与代谢重编程有关，如糖酵解/糖异生途径。此外，XLP显著降低了糖酵解途径中Gapdh和Ldha水平的增加（补充图S1），与qRT-PCR分析一致（图4F-G）。XLP还增加了Acod1 mRNA水平（图4H）。因此，这些结果进一步验证了XLP对结肠能量代谢的影响。

图4 XLP对UC小鼠结肠组织转录组学的影响（n=4）。XLP处理前后（A）和（B）的基因表达存在差异。（C）DSS诱导和XLP处理后共同的差异基因。XLP处理前后（D）和（E）差异基因的KEGG分析。（F）Gapdh、（G）Ldha和（H）Acod1的相对mRNA水平。数据以平均值±标准差表示。采用Bonferroni检验的单因素方差分析进行统计分析，多重比较采用Bonferoni校正。显著性水平表示为*P

5. ITA改善XLP对UC和M1巨噬细胞极化的调节作用

最近的研究表明，ITA可以调节炎症反应。在此，我们探讨了升高的ITA是否会影响XLP对UC的作用。研究流程图如图5A所示。与DSS组相比，ITA显著改善了UC小鼠的体重减轻，降低了DAI，增加了结肠长度（图5B-D）。组织病理学观察显示，ITA修复了肠道损伤，减少了结肠组织中炎性细胞的存在（图5E）。这些结果表明，ITA在UC中具有治疗潜力，特别是在与XLP联合使用时，观察到协同作用。此外，ITA和XLP均显著减少了MLN内F4/80+CD11c+巨噬细胞的数量（P

图5 ITA对XLP对UC和M1巨噬细胞极化的调节作用的影响。（A）研究小组的流程图。（B）体重的变化。（C）DAI评分。（D）结肠的长度。（E）结肠H&E染色。（F）MLN中F4/80+CD11c+巨噬细胞的百分比。（G）Gapdh和（H）Ldha的相对mRNA水平。数据以平均值±标准差的形式呈现。采用单因素方差分析（ANOVA）结合Bonferroni检验进行统计分析，并对多重比较进行Bonferoni校正。（C）代表通过Kruskal-Wallis单因素方差分析结合Dunn事后检验、Bonferroni多重比较校正分析的个体小鼠。与DSS组相比，*P

6. ITA通过抑制TET2/STAT1和TET2/NF-κB通路降低M1巨噬细胞的极化和炎症反应

在确定ITA通过减少极化M1巨噬细胞来改善XLP治疗后的UC后，我们进一步研究了ITA是否可以在RAW264.7细胞上直接抑制M1巨噬细胞极化。通过检测各种指标的mRNA水平，包括TNF-α、IL-6、iNOS和IL-1β，我们证实了巨噬细胞从M0极化到M1的表型。然而，ITA逆转了TNF-α、IL-6、iNOS和IL-1βmRNA表达水平的上调（图6A-D）。免疫荧光染色显示，在从M0到M1的极化过程中，巨噬细胞的体积增加，而TNF-α、IL-6和iNOS的表达增加。ITA下调了这些标志物的表达（图6E），表明其具有抑制M1巨噬细胞极化的潜力。这一发现与转录组学和能量代谢分析的结果一致，因为ITA不仅降低了M1巨噬细胞中Gapdh和Ldha的mRNA水平（图6F-G），还抑制了Gapdh与Ldh的活性（H-I）。这些表明ITA对Gapdh和Ldh酶活性的抑制作用。此外，结果表明，ITA显著降低了M1巨噬细胞中的TET2 mRNA水平（图6J）。ITA显著降低了STAT1、CXCL9和CXCL10的mRNA水平（图6K-M），表明它抑制了TET2/STAT1通路。同样，ITA分别下调了Nfkbiz和NF-κB的mRNA和蛋白质表达水平（图6N-O），表明其具有抑制TET2/NF-κB通路的潜力。这些发现表明，ITA通过抑制TET2/STAT1和TET2/NF-κB通路来降低M1巨噬细胞的炎症反应。

图6 ITA对M1巨噬细胞极化和炎症反应的影响（n=4-5）。（A）TNF-α、（B）IL-6、（C）iNOS和（D）IL-1β的相对mRNA水平。（E）TNF-α、IL-6和iNOS的免疫荧光染色。（F）Gapdh和（G）Ldha的相对mRNA水平。（H）Gapdh和（I）Ldh的酶活性。（J）TET2、（K）STAT1、（L）CXCL9、（M）CXCL10和（N）Nfkbiz的相对mRNA水平。（O）NF-κB蛋白的免疫荧光染色。数据以平均值±标准差表示。采用Bonferroni检验的单因素方差分析进行统计分析，多重比较采用Bonferoni校正。显著性水平表示为*P

在这项研究中，我们评估了XLP对UC小鼠的治疗效果。与DSS组相比，XLP在我们的UC模型中具有更好的治疗效果。在XLP处理的小鼠中观察到的体重减轻、DAI评分和结肠长度的改善表明了这一点。此外，XLP降低了结肠黏膜损伤和促炎细胞因子水平（TNF-α和IL-6），这与我们之前的发现一致。

结肠黏膜损伤诱导免疫细胞，特别是极化的M1巨噬细胞的浸润，导致促炎细胞因子的释放，如TNF-α、IL-6和IL-1β，从而诱导UC的发作。结果表明，XLP下调TNF-α和IL-6，可能是由于极化M1巨噬细胞水平降低。流式细胞术显示，XLP剂量依赖性地降低了MLN中F4/80+CD11c+巨噬细胞的水平。XLP还下调了结肠组织中F4/80和CD11c的表达。F4/80和CD11c是M1巨噬细胞表面的生物标志物。这些结果表明，XLP通过抑制极化的M1巨噬细胞来缓解溃疡性结肠黏膜的炎症反应。XLP成分分析表明，药根碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱是CR的主要成分，而木香烃内酯和脱氢木香内酯主要来源于木香。研究报告称，这些化合物通过降低M1巨噬细胞水平发挥抗炎活性。因此，XLP可以通过其多种成分的协同作用治疗UC。

研究表明，代谢重编程在促进M1巨噬细胞极化方面起着关键作用。我们的研究结果表明，XLP可能通过调节结肠中的能量代谢来发挥其抗炎作用。XLP似乎将结肠组织中的代谢特征逆转至正常状态。这包括乳酸水平的降低和ATP的增加，可能会影响柠檬酸盐循环、氧化磷酸化和糖酵解等关键代谢途径。这些结果表明，XLP可以通过减少糖酵解来减少乳酸的产生，同时通过促进氧化磷酸化来增加ATP的产生，从而逆转能量代谢模式。糖酵解在促使巨噬细胞向M1表型极化方面至关重要。最近的一项研究发现，糖酵解诱导的乳酸积累进一步诱导了巨噬细胞极化。因此，XLP可以通过抑制糖酵解来抑制M1巨噬细胞的极化。XLP处理后共鉴定出1795个共同差异基因和9个共同信号通路。此外，XLP显著降低了Gapdh和Ldha mRNA水平，这与乳酸和糖酵解抑制作用的降低是一致的。此外，XLP降低了顺乌头酸水平，增加了ITA水平。观察到的ITA水平的增加可能与Acod1活性的增强有关，Acod1是负责ITA产生的酶（图3J和图4H）。这些发现表明，XLP通过下调糖酵解和增加柠檬酸循环中的ITA来降低M1巨噬细胞的极化。

这些发现表明，ITA的增加可能会促进XLP在UC治疗中的作用。结果进一步表明，ITA对UC小鼠具有治疗作用。ITA和XLP的组合进一步提高了这种功效，这意味着ITA和XLP的协同作用。结果还表明，ITA降低了F4/80+CD11c+巨噬细胞水平，当ITA和XLP联合使用时，这种影响更好。这些数据表明，在XLP治疗UC期间，ITA的增加在抑制M1巨噬细胞极化方面很重要。此外，ITA显著降低了TNF-α、IL-6、iNOS和IL-1βmRNA的水平，以及TNF-α、IL-6和iNOS蛋白的表达，表明对M1巨噬细胞极化的抑制作用，并与ITA调节巨噬细胞活化过程中炎性细胞因子产生的研究一致。此外，ITA和XLP导致UC小鼠Gapdh和Ldha的相对mRNA水平显著降低。此外，单独使用ITA可降低巨噬细胞中Gapdh和Ldha的相对mRNA水平，并抑制其酶活性。这些发现表明ITA对Gapdh和Ldha具有抑制作用，这证实了转录组和能量代谢分析。这一数据也得到了先前研究的支持，即ITA降低了Gapdh的表达和活性，从而抑制了糖酵解，并有助于激活巨噬细胞的抗炎作用。尽管ITA对Gapdh和Ldha的抑制作用已经得到证实，但尚不清楚这些作用是否是由于ITA直接与这些蛋白质结合，从而抑制了它们的活性。未来的研究可以通过分子对接研究和体外实验验证进一步阐明ITA对Gapdh和Ldha的调节机制。

此外，我们还探讨了ITA如何抑制M1巨噬细胞的炎症反应。结果显示，ITA降低了M1巨噬细胞的TET2 mRNA水平。TET2是一种催化5-甲基胞嘧啶迭代氧化的双加氧酶，对免疫细胞的分化和增殖至关重要。这些数据表明，TET2可能是ITA调节炎症反应的关键蛋白。STAT1和NF-κB是TET2在炎症启动过程中的下游信号。在此，ITA降低了STAT1及其下游促炎趋化因子CXCL9和CXCL10的mRNA水平，从而降低了炎症免疫反应。ITA还降低了NF-κB的mRNA和蛋白质水平，部分解释了TNF-α和IL-6水平的降低。这些发现表明，ITA通过下调TET2/STAT1和TET2/NF-κB通路降低了M1巨噬细胞的炎症反应。

总的来说，这项研究的主要重点是研究能量代谢产物ITA在XLP抑制M1巨噬细胞极化时如何影响UC。然而，中药方剂对免疫细胞能量代谢的影响是复杂的。例如，该研究表明，XLP处理抑制了糖酵解；然而，这种抑制对M1巨噬细胞极化的影响尚不清楚。研究表明，缺氧在糖酵解基因的上调中起着至关重要的作用，从而促进M1巨噬细胞的极化。在此背景下，假设XLP成分可能通过与糖酵解相关基因（如Gapdh、Ldha和TET2基因）相互作用来抑制M1巨噬细胞极化，HIF-1识别的缺氧反应元件（HRE）位于Gapdh，Ldha和TET2基因的启动子区域，促进其转录。我们假设XLP的成分可能与Gapdh、Ldha和TET2启动子区域内的HRE位点相互作用。根据XLP提取物中鉴定的六种化合物（图1B），药根碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱中的甲氧基和醚键等特定官能团，以及木香烃内酯和脱氢木香内酯中的酯键，可能通过氢键或范德华相互作用与HREs位点结合。据推测，这种相互作用可能会阻碍HIF-1与HRE的结合，从而降低Gapdh、Ldha和TET2的转录。在未来的工作中，有必要通过分子对接研究、体外实验验证和RAW264.7细胞的活性评估来验证这一潜在假设。因此，本研究通过阐明XLP对UC小鼠模型炎症免疫反应的影响，阐明了XLP作为治疗方法的潜力。

结论

XLP可以通过抑制M1巨噬细胞极化来治疗UC，其抑制作用部分由ITA水平的增加介导。因此，通过XLP控制能量代谢产物的水平（特别是增加的ITA）可能是治疗UC的有效方法。我们的研究强调了ITA在调节UC免疫炎症方面的潜力。此外，观察到的能量代谢和巨噬细胞极化的变化表明了中药方剂的新作用机制。

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来源：好艾健康群