摘要：2023年9月，中国科研团队在期刊Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF:11.3）发表了一篇题为“ATR-binding lncRNA ScaRNA2 promotes cancer res
文章介绍
2023年9月，中国科研团队在期刊Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF:11.3）发表了一篇题为“ATR-binding lncRNA ScaRNA2 promotes cancer resistance through facilitating efficient DNA end resection during homologous recombination repair”的文章。
#1
摘要
Abstract
既往研究发现，长链非编码RNA（lncRNA）在与ATR结合后，对ATR的正常功能及癌细胞的耐药性都非常关键。但是，科学家并不清楚哪些lncRNA对ATR的激活起到了重要作用，因此在对这一重要的生物过程的理解上受到了很大的限制。为了解决这个问题，科学家们采用了一种名为RNA免疫沉淀（RIP）的技术，并结合RNA测序，来找出与ATR结合的lncRNA。还使用了RIP-qPCR进行验证。
其中，一种名为scaRNA2的lncRNA是与ATR结合得最多的。而且scaRNA2对于同源重组（HR）所介导的DNA损伤修复过程至关重要。如果敲除scaRNA2，ATR及其相关的分子在DNA损伤时就不能被正常地召集到损伤部位。进一步的研究发现，scaRNA2对于Exo1所介导的DNA末端切除过程也必不可少，它还能将MRN复合物与ATR的激活过程连接起来。如果人为地去掉scaRNA2，癌细胞就会变得对多种与DNA损伤相关的化学放疗更加敏感。他们还发现，在那些对放疗抵抗的患者体内，与ATR结合的scaRNA2的数量也明显增加。
#2
研究思路
Methods
本研究的主要目的是探讨ScaRNA2与ATR结合后在癌症耐药中的作用，以及它如何通过促进高效的DNA同源重组修复（HRR）来实现这一效果。研究团队使用了10%或12.5%的SDS-PAGE凝胶制备试剂盒来分离蛋白质裂解物，研究还涉及了细胞培养、Western blot、免疫组化染色以及RNA干扰等实验技术，以深入探索ScaRNA2的功能和作用机制。为了验证ScaRNA2在癌症耐药中的作用，研究团队还使用了小鼠模型进行实验。
综合来看，本研究综合运用了细胞生物学、生物化学、分子生物学和动物模型等多种实验方法，力求全面揭示ScaRNA2这个与ATR结合的lncRNA在癌症耐药性的作用，并深入剖析其潜在的机制。
#3
主要结果
Results
ScaRNA2被鉴定为与ATR结合最多的lncRNA；
ScaRNA2对于HR介导的DNA损伤修复是必需的；
ScaRNA2是Mre11和Exo1介导的DNA末端切除所必需的；
DNA末端切除的缺陷会损害scaRNA2介导的ATR激活；
ScaRNA2将DNA末端切除复合物与ATR激活联系起来；
ScaRNA2敲低可增加结直肠癌细胞和患者来源类器官（PDO）模型对放疗的敏感性；
敲低scaRNA2可以提高结直肠癌异种移植瘤的放疗疗效；
高水平的ScaRNA2预示着放疗抵抗患者的预后不良。
图1 ScaRNA2作为一种与ATR结合的lncRNA的特性，以及它对转录组的影响。A. ScaRNA2是一种与ATR结合的lncRNA，并对其进行了表征。还对HCT116细胞裂解液中的ATR进行了特异性抗体分析，并用RIP和测序技术进行了图形化展示。B. 根据RIP-seq表达水平，展示了前30个ATR结合lncRNA的柱状图。C. 在HCT116细胞中，用ATR特异性抗体进行了RIP-qPCR分析，以确认ATR结合lncRNA。D. 用HCT116细胞中的特定scaRNA2探针进行了RNA FISH染色。E. 从HCT116细胞中提取的核和细胞质RNA中确定了相对scaRNA2的表达。F. 展示了RIP实验中免疫印迹ATR片段的代表图像。G. 在ATR RIP复合物中测量了scaRNA2的相对表达。H. 用生物素标记的scaRNA2的正向和反义探针进行了RNA pulldown实验。I. 使用RNAfold软件预测了scaRNA2的结构。J. 展示了用scaRNA2全长（SCA-FL）、scaRNA2片段1（SCA-F1）、scaRNA2片段2（SCA-F2）及其反义序列进行的RNA pulldown实验中的ATR代表图像。K. 对受scaRNA2影响的关键信号通路进行了GO分析。
图2 ScaRNA2对于HR介导的DNA损伤修复是必需的。A-B：使用RT-PCR检测HCT116和HT29细胞中scaRNA2的表达。C-D：显示了HCT116和HT29细胞在照射前2小时使用ATM抑制剂（KU55933）、ATR抑制剂（VE821）和DNA-PKcs抑制剂（NU7441）处理后的scaRNA2表达。E：免疫荧光染色显示照射后的sg-ctrl和scaRNA2敲低HCT116细胞中的γH2AX和53BP1。F-G：定量γH2AX和53BP1在每个时间点的焦点。H：代表性图像。I：NHEJ和HR报告测定示意图。J-K：使用报告系统检测NHEJ修复和HR修复效率，并用流式细胞术进行定量。L-M：代表性图像和定量BRCA1焦点。
图3 ScaRNA2对于有效的Mre11和Exo1介导的DNA末端切除是必需的。A：免疫荧光染色显示细胞在照射后指定时间点的RAD51和RPA2焦点。B-C：在有无scaRNA2敲低的受照射HCT116细胞中，每个细胞核中RAD51焦点和RPA2焦点的数量。D-E：用BrdU标记24小时后染色BrdU。F-M：在照射后通过免疫荧光染色检测HCT116细胞中负责DSB水平的主要DNA末端切除核酸酶。
图4 ScaRNA2敲除导致ATR失活，导致HR缺陷。A-B：HCT116细胞和HT29细胞有/无ScaRNA2敲除，接受8 Gy照射，并在指示时间点检测参与DNA损伤应答的蛋白质。C-D：用免疫荧光染色检测HCT116细胞中ATR和TOPBP1的激活情况。E：在有无ScaRNA2敲低的受照射HCT116细胞中，每个细胞核中ATR焦点和TOPBP1焦点的数量。F：sg-ctrl和scaRNA2敲低HCT116细胞接受8 Gy照射，提取染色质分离蛋白。用蛋白质印迹检测包括ATR、MRN复合物和Exo1的蛋白质。G：对所示四组中每种蛋白质的原始密度进行定量和统计分析。
图5 ScaRNA2将RPA-ssDNA与MRN复合物的组装和ATR的募集联系起来。A-C：通过RNA pulldown和质谱鉴定scaRNA2结合蛋白的示意图。B-C：为电泳分离后的蛋白质银染代表性图像。D：通过在照射后的HCT116细胞中使用特异性抗体进行RIP实验，确定了scaRNA2与RPA2、Mre11和RAD51的结合情况。E：使用生物素标记的scaRNA2和照射后的HCT116细胞的蛋白裂解液进行了RNA pulldown分析。F：使用生物素标记的scaRNA2 FL、scaRNA2 F1和scaRNA2 F2转录本，确定了scaRNA2片段与MRN复合物的结合情况。G-H：在sg-ctrl和scaRNA2敲低HCT116细胞中，用ATR或Mre11抗体进行免疫沉淀。I：为照射后存在与不存在scaRNA2的MRN组装和ATR募集的示意图模型。
图6 敲低scaRNA2增加了癌细胞对放化疗的敏感性。A-D：对照sg-ctrl和敲低scaRNA2的HCT116细胞在受到照射、CPT、依托泊苷或奥拉帕利处理后，在所示剂量（浓度）下使用克隆形成测定法确定的存活情况。E-F：使用流式细胞术和Annexin V/PI双染色法测量了对照sg-ctrl和敲低scaRNA2的HCT116细胞在受到照射、CPT和ETO处理后的细胞凋亡情况。G：检测细胞中涉及细胞凋亡信号通路的蛋白质。H：直肠癌患者来源的类器官（PDO）被培养并被感染对照sg-ctrl和sg-scaRNA2慢病毒。图片在照射后的第1-8天以40倍放大拍摄。计算了每个视野中不同组的PDO数量。
图7 敲低scaRNA2使结直肠癌对放疗更敏感。使用细胞来源的异种移植瘤（CDX，A-G）和患者来源的异种移植瘤（PDX，H-M）来确定敲低scaRNA2对放疗敏感性的影响。A：sg-ctrl和敲低scaRNA2 HCT116细胞的植入、局部照射和测量时间安排。B-C：在局部照射剂量为15 Gy的照射或未照射肿瘤中，每隔两天记录肿瘤体积。在照射后30天，测量各组的肿瘤重量。D-G：使用免疫组化对从sg-ctrl和敲低scaRNA2肿瘤中分离出的肿瘤组织中的p-ATR、p-Chk1、RAD51和γH2AX进行染色。H：建立来自直肠癌患者的PDX模型的示意图。I：照射后30天分离的sg-ctrl、sg-ctrl+IR、sg-scaRNA2和sg-scaRNA2+IR组的代表性肿瘤图像。J-K：在局部照射剂量为15 Gy的照射或未照射肿瘤中，每隔三天记录肿瘤体积。在照射后30天，测量各组的肿瘤重量。L-M：用HE染色和免疫组化染色分离的来自对照组和敲低scaRNA2肿瘤中的肿瘤组织的TUNEL、Ki67和γH2AX。
图8 高水平的ScaRNA2预示着直肠癌对放疗的反应不佳。A：对80例直肠癌患者的肿瘤组织进行手术切除，并根据TRG评分对放射敏感性进行分类。B-C：对放射敏感组和放射抵抗组肿瘤每个切片的ScaRNA2阳性细胞和阳性细胞密度进行定量分析。D：在相同的切片上用免疫荧光染色法和FISH法检测ATR（红色）和ScaRNA2（绿色），以可视化ATR和ScaRNA2的共定位。E-F：对放射敏感组和放射抵抗组中ATR和ScaRNA2共定位的阳性细胞和阳性细胞密度进行定量分析。G：对直肠癌患者的微阵列进行Kaplan-Meier生存分析。H：提出了一个可能的机制模型，说明ScaRNA2如何通过促进DNA末端切除来调节DNA损伤修复和癌症抵抗。
总结
本研究表明，ScaRNA2是与ATR结合最为丰富的lncRNA，对于介导DNA损伤的同源重组修复是必要的。ScaRNA2的表达水平受到DNA损伤诱导，其缺失会导致DNA损伤修复的抑制，从而增加细胞对DNA损伤的敏感性。此外，本文还发现ScaRNA2通过影响DNA末端剪切酶Exo1的招募和ATR的激活，调节同源重组修复机制。这些发现揭示了ScaRNA2在DNA损伤修复中的重要作用，为深入理解DNA损伤修复机制提供了新的思路和策略。此外，这些发现还为开发新的治疗策略和药物提供了潜在的靶点。
参考信息
ATR-binding lncRNA ScaRNA2 promotes cancer resistance through facilitating efficient DNA end resection during homologous recombination repair.J Exp Clin Cancer Res. 2023 Sep 30;42(1):256. doi: 10.1186/s13046-023-02829-4.PMID: 37775817 PMCID: PMC10542231.
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来源：培养盒守护者