摘要：● 通讯作者：翟齐啸（zhaiqixiao@jiangnan.edu.cn）,陈连民（lianminchen@njmu.edu.cn）,孔祥清（kongxq@njmu.edu.cn）

从中国分离的肠道微生物基因组阐明了益生菌和心脏代谢效应

● 期刊：Cell Genomics(IF:11.1)

● DOI：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2024.100559

● 原文链接: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666979X24001253?via=ihub

● 第一作者：Pan Huang，Quanbin Dong，Yifeng Wang

● 通讯作者：翟齐啸（zhaiqixiao@jiangnan.edu.cn）,陈连民（lianminchen@njmu.edu.cn）,孔祥清（kongxq@njmu.edu.cn）

● 发表日期：2024-6-12

● 主要单位：

江南大学食品科学与技术学院、南京医科大学附属第一医院、南京医科大学附属常州第二人民医院、南京医科大学附属苏州医院

摘要abstract

作者发布了中国肠道微生物参考（CGMR）目录，该目录包含从全国范围内收集的3234个中国肠道宏基因组中获得的3707个非冗余物种的101060个高质量组装基因组。相较于全球数据库，发现了987个新物种，提高了基因定位的准确性。通过与宿主表型的关联性分析，进一步展现了这些微生物的益生作用以及对心脏代谢的影响，并且通过小鼠实验进行了验证。

亮点Highlight

● 101060个基因组集合与来自中国肠道宏基因组的1376个分离株配对

● 987个新物种相对于全球数据库提高了可比对率

● 微生物基因组具有区域特异性，并与宿主表型相关

● 用小鼠验证了分离株潜在的益生菌和心脏代谢作用

摘要Summary

肠道微生物组在不同人群之间表现出遗传差异，而中国肠道微生物组基因组的特征描述图谱仍然有限。在此，我们介绍了中国肠道微生物参考（CGMR）集，涵盖了101060个高质量宏基因组组装基因组（MAG）。包括来自中国主要农村地区的3234个粪便样本的3707个非冗余物种、1376个主要来自乳酸菌的活分离株，以及相对于全球数据库的987个新物种。在其中，我们观察到了区域特异性共存的MAG和具有益生菌和心脏代谢功能的MAG。初步的小鼠实验表明，两种肠道粪杆菌分离株在缓解便秘方面具有益生菌作用、三种脆弱拟杆菌A分离株对肥胖患者的心脏代谢有影响，以及副拟杆菌属和乳酸杆菌属分离株在宿主脂质代谢中有作用。我们的研究通过配对分离株扩展了当前的微生物基因组，并证明了潜在宿主效应，有助于理解宿主-微生物相互作用机制。

引言Introduction

肠道微生物组成的变化与人类健康息息相关，涉及心血管疾病（CVD）、肥胖症、炎症性肠病（IBD）以及糖尿病等病症。然而，这些关联背后肠道微生物的功能潜力在很大程度上尚未得到深入探究。这是因为许多微生物尚未被分离出来，其基因组也未得到充分解析。因此，对多样的微生物基因组进行表征并培养活体微生物，是揭示微生物在人类健康与疾病中所起作用的重要一步。

近年来，研究人员致力于通过对来自不同人群的样本进行大规模宏基因组组装，从而构建全面的微生物参考基因组。与此同时，数千种肠道微生物分离株也已被培养出来，这有助于从机制层面理解宿主与微生物之间的相互作用，以及微生物在临床转化中的益生潜力。然而，上述研究中所使用的宏基因组样本大多来自欧洲裔个体，仅有约10%来自亚洲。在中国，已报道的微生物基因组在样本规模和特定区域方面均存在局限。值得注意的是，一些优势菌种在全球范围内均有发现，但在不同人群中呈现出遗传差异。那些表现出最显著的共同多样化的菌种，已独立发展出与宿主依赖性相关的特征，这凸显了理解特定人群微生物菌株对微生物组相关疾病表型潜在影响的必要性。由此，在中国全国范围内扩充微生物基因组和分离株，或许能为该领域添砖加瓦，并对基于微生物群的疗法的通用性产生影响。

在此，我们展示了来自中国大陆30个省份随机收集的3234份粪便样本中，共计101060个宏基因组组装基因组（MAGs），称之为中国肠道微生物参考（CGMR）集。这些MAGs可以聚类为3707个非冗余物种，其中987个物种是与现有数据库相比新报道的物种，包括来自特伦托大学细胞、计算和整合生物学系（CIBIO）的数据集，该数据集包含超过150000个基因组；统一人类胃肠基因组目录（UHGG）包含204938个参考基因组；魏茨曼科学研究所（WIS）的数据集包含241118个基因组；早期生命肠道基因组（ELGG）目录包含32277个基因组；包含5927个基因组的内蒙古肠道基因组（IMGG）数据集以及基因组分类数据库（GTDB）。此外，我们培养了总计1376个MAG配对的活菌株，主要来自乳酸菌，但也包括两个新识别物种的两个菌株。通过将MAGs与地理和表型特征相关联，我们观察到特定区域共存的MAGs以及具有益生菌和心血管代谢功能的MAGs。

基于现有的分离菌株，本研究进一步深入探究了两株不同的肠道粪便杆菌（Faecalibacillus intestinalis）分离株在缓解便秘方面潜在益生效果的功能验证。我们研究了三株脆弱拟杆菌A（Bacteroides fragilis_A）分离株对肥胖个体心脏代谢的影响，以及属于副拟杆菌属（ParaBacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）的两个新发现物种的分离株在宿主脂质代谢方面的功能潜力。本研究不仅通过配对分离菌株扩充了微生物基因组数据库，还旨在阐明这些菌株作为益生菌以及宿主心脏代谢调节剂的特性。这一努力有助于增进当前对宿主-微生物互作的理解，并推动基于微生物组的个性化治疗的发展。

结果Result

中国人肠道微生物组的基因组图谱

为了全面表征中国人群肠道微生物的基因组图谱，我们在全国范围内收集了来自中国大陆30个省份3234名参与者的粪便样本（图1A）。通过宏基因组测序，我们为每个样本获得了平均6500万对序列读长（20GB）。我们采用了单样本宏基因组从头组装流程（图1B），在现有工作流程的基础上进行构建。按照我们的流程（图1B），共获得了292550个宏基因组组装基因组（MAGs），其中101060个符合宏基因组组装基因组的最小信息标准（MIMAG）。其中44875个MAGs的完整性≥50%，污染率50）被认为是中等质量，而56185个MAGs的完整性≥90%，污染率50）被认为是高质量。值得注意的是，组装的基因组质量很高，完整性的中位数为88.28%，污染率的中位数为0.98%（图1C；表S1）。101060个MAGs的中位数大小为2.20MB（四分位间距[IQR]=1.75-2.71Mb），N50值从1.8kb到1.05Mb不等（表S1）。我们将这一集合称为中国肠道微生物参考（CGMR）集。

图1 | 中国肠道微生物组参考（CGMR）数据集

（A）从中国大陆获取的3234个样本的地理分布及表型特征。蓝色深浅代表每个省份采集的样本数量。直方图展示了参与者的年龄和体重指数（BMI）分布。表格总结了研究中涉及的主要民族。

（B）用于微生物基因组重建与比较的宏基因组组装策略及数据集概述。

（C）101060个宏基因组组装基因组（MAGs）的基因组质量分布。由CheckM评估的中等质量（粉色）和高质量（蓝色）基因组的完整性和污染度数值。颜色深浅表示MAGs的密度。

（D）不同测序深度下每个样本获得的MAGs总数。每个点代表一个样本，x轴表示配对的干净读长数量，y轴表示每个样本获得的MAGs数量。箱线图展示了MAGs数量的中位数、第一四分位数和第三四分位数。上下须线分别延伸不超过1.5×四分位距（IQR）。离群值单独绘制。

（E）所有3707个代表性物种水平MAGs的系统发育树。分支上的颜色代表细菌门类，而外圈颜色表示与现有基因组参考相比新鉴定出的物种。外圈条形的长度代表每个代表性物种获得的MAGs总数，不同颜色的条形数量代表每个代表性物种的个体数量。

（F）CGMR与6个现有基因组集合的比较。桑基图展示了CGMR MAGs与现有微生物基因组集之间的联系。维恩图显示了CGMR与其他基因组集相比的独特MAGs，并标明了各自数量。桑基图下方的维恩图展示了CGMR的MAGs与UHGG中源自中国的MAGs（UHGG-CN）的重叠部分。

值得注意的是，与近期研究相比，我们的测序数据读长深度约为其四倍。平均而言，我们每个样本获得31个宏基因组组装基因组（MAGs），是先前研究所得数量的两倍。我们还观察到读长深度与每个样本获得的MAGs数量之间呈正相关（图1D）。每个样本获得的MAGs总数在约8000万读长时达到最佳水平（图1D），这表明深度测序对于获得足够数量的MAGs至关重要。

此外，我们利用来自公共宏基因组研究的一个中国人群队列（n=370）和一个欧洲人群队列（n=183），以研究将中国肠道微生物参考（CGMR）中的MAGs整合后读长比对的提升情况。使用人类胃肠道基因组（UHGG）数据集以及UHGG和CGMR的合并数据集，对这两个队列的原始读长进行比对。将CGMR数据集并入UHGG数据集后，中国样本（p=5.58×10⁻⁸²）和欧洲样本（p=8.85×10⁻²¹）的平均比对率均显著提高（图S1）。因此，将CGMR数据集纳入现有数据集可显著提高比对率，拓宽我们对肠道微生物的理解。

接下来，我们以95%的平均核苷酸同一性（ANI）为阈值对这些宏基因组组装基因组（MAGs）进行聚类，从而分析其分类学特征，得到了3707个具有代表性的原核生物物种（图1E；表S2）。利用基因组分类数据库工具包（GTDB-Tk），可进行分类注释的基因组隶属于28个门、37个纲、93个目、215个科以及972个属（表S2）。优势门类包括厚壁菌门（Firmicutes_A）、拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）（图1E）。与魏茨曼科学研究所（WIS，2365个属和627个科）和特伦托大学细胞、计算与整合生物学系（CIBIO，2640个属和778个科）的数据集相比，我们的中国肠道微生物参考（CGMR）数据集包含的细菌属和科数量较少，尽管代表性物种的数量相同。这表明中国人群的肠道微生物基因组图谱具有独特的组成。此外，我们将人类胃肠道基因组（UHGG）中属于中国人群的MAGs（UHGG-CN）与CGMR的数据进行合并。结果，又有1181个物种被纳入到CGMR中（图1F）。

CGMR通过增加987个新物种扩展了当前的微生物基因组

微生物基因组是探索微生物多样性、理解微生物群落结构与功能的重要资源。然而，尽管已有研究报道了来自全球人群的超20万个MAGs，但针对中国人群样本的研究数量有限，且主要集中于城市地区。

为了展示我们的CGMR数据集的价值，我们将3707个物种水平的代表性基因组，与从CIBIO、UHGG、WIS、ELGG以及IMGG获取的现有微生物基因组进行了比较。以95%的平均核苷酸同一性（ANI）为阈值聚类，我们发现与CIBIO、UHGG、WIS、ELGG和IMGG相比，CGMR数据集分别有1834、1640、1989、2662和2809个基因组为新发现的。重要的是，在这3707个物种水平的代表性基因组中，有1371个（37%）未被上述研究涵盖（图1F；表S3）。987个新物种的鉴定突出了CGMR数据集的独特性。此外，这些结果强调了在探索人类肠道微生物群时，获取更多测序数据的必要性。

我们使用基因组分类数据库工具包（GTDB-Tk）对1371个独特的物种水平代表性MAGs进行了分类注释。其中，987个MAGs在物种水平上无法进行分类学归类，110个在属水平上无法注释，并且其中一个（FNXYCHL24.61）无法归入现有目级分类，已鉴定的新物种中有20.6%出现在多个样本中（图S2A）。为了进一步探究这些物种的潜在功能，我们运用gutSMASH和Prokka来预测代谢基因簇（MGCs）和基因功能。我们的分析揭示了这些物种具有多种功能，包括短链脂肪酸（SCFAs）和维生素的生物合成（图S2B和S2C）。

CGMR的地理特征及共生物种

中国地域广袤，地理环境多样，不同地区地貌景观各异。这些地理特征造就了丰富多样的区域特定环境与生活方式，而这极有可能影响肠道微生物群落的分布。我们依据中国政府基于地理位置、民族及经济状况差异所划分的区域，将全国划分为7个地区（图2A）。通过分析物种水平的代表性MAGs，我们识别出115个在至少一个地区中流行率超过10%的MAGs（表S4）。值得注意的是，我们发现45个MAGs（来自34个属）普遍存在于所有7个地区（图2A）。在这些常见物种中，有几种已被表明具有益生潜力，如嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）、肠道粪便杆菌（F. intestinalis）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）和假链状双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）（表S4）。此外，分别有14个和12个MAGs与地区和年龄相关（表S5）。这些研究结果表明，在中国不同地区，均存在可能有助于维持肠道微生物群落健康与平衡的有益微生物。

图2 | 区域特异性和共现MAGs以及与宿主表型的关联

（A）普遍存在的物种水平MAGs的地理分布。地图展示了中国的七个区域，颜色表示物种水平MAGs的流行程度。左图：水平条表示每个区域中普遍存在的物种水平MAGs的总数。垂直条代表特定区域之间共享的普遍存在的物种水平MAGs的数量，底部彩色圆点突出显示这些区域。不同深浅的蓝色表示仅特定于一个区域的普遍存在的物种水平MAGs。

（B）基于物种水平MAGs流行程度的共现网络。每个圆点代表一个物种，并标注其名称，灰色线条连接两个圆点表示物种水平上存在显著的共现关系（错误发现率FDR

（C）物种水平MAGs流行程度与宿主表型的关联。条形代表宿主表型，按显著关联数量排序。关联方向用颜色编码，粉色表示正相关，蓝色表示负相关。每个条形的长度表示在FDR

值得注意的是，我们鉴定出27个地区特异性的MAGs，其中19个特异于中国东北和华北地区（图2A）。尽管东北地区样本数量最少（图S3），却展现出数量最多的地区特异性物种，包括来自厌氧丁酸杆菌属（Anaerobutyricum）、布劳特氏菌属（Blautia）、丁酸杆菌属（Butyribacter）、梭菌属（Clostridium）、粪球菌属（Coprococcus_A）、埃格特菌属（Eggerthella）、拟杆菌属（Evtepia）、毛螺菌属（Lachnospira）、地中海杆菌属（Mediterraneibacter）、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter_A）、瘤胃球菌属（Ruminococcus_E）以及苏黎世杆菌属（Turicibacter）的12个物种（图2A及表S4）。

除了地区特异性物种的MAGs，我们还研究了在肠道生态系统的组织与维持中可能发挥关键作用的微生物类群。这些类群在微生物共现网络中占据核心位置。我们共识别出95213个显著的共现关系，涉及3462个物种水平的MAGs（错误发现率FDR

与多种宿主表型相关的MAGs的流行情况

除地理特征外，我们还收集了研究参与者的210种表型信息。这些表型涵盖人体测量特征（如年龄、性别和体重指数BMI）、居住地点（城市和农村）、饮食习惯、生活方式，以及疾病史和用药情况（表S7）。连续型特征，如BMI，呈正态分布（图1A）。对于二分型特征，如居住地点，在七个地区中分布均匀（图2A），其中41.6%的参与者居住在城市地区，58.4%居住在农村地区（图1A；表S7）。在基于宿主健康状况对包含3707个代表性宏基因组组装基因组（MAGs）的聚类进行分析时，我们发现在3707个MAGs中，162个仅在不健康的宿主中发现，2377个仅在健康宿主中发现。此外，1168个MAGs在健康和不健康宿主中均有出现（表S2）。

我们共确定了MAGs流行率与各种表型特征之间的371个显著关联（错误发现率[FDR]

此外，我们确定了98个与居住地点（城市或农村）相关的MAGs，这些MAGs主要富集于77个属的物种（错误发现率[FDR]

再者，我们观察到16个MAGs与排便频率相关，3个MAGs与体重指数（BMI）相关（FDR

1376个与MAGs配对的细菌分离株的功能探究

对活体微生物分离株进行培养，有助于更全面地研究肠道微生物群，包括确定与疾病相关的代谢功能，以及对下一代益生菌进行特性描述。为此，我们从982份粪便样本中分离出活体微生物，其中664份样本与粪便宏基因组测序数据相对应。我们使用了27种不同的培养基，主要为MRS培养基及类似改良培养基（图S4；表S8），成功分离出总计1376株菌株，这些菌株主要来自乳酸菌和双歧杆菌属物种。随后，我们对这些分离株进行了全基因组测序，获得了高质量的基因组，平均完整性达99.4%，污染率为1.1%（图3A；表S9）。

图3 | 1376个细菌分离株概述

（A）基于基因组草案的1376个活体分离株的系统发育树。此系统发育树描绘了1376个细菌分离株之间的亲缘关系，外圈颜色代表与现有基因组参考相比，每个分离株所属的菌门。

（B）分离株-宏基因组组装基因组（MAG）配对。平行坐标图展示了1376个分离株（左）、88个物种水平代表性MAG（中）及其相应属信息（右）之间的联系。连接各板块的曲线表示它们之间的关联，颜色对应不同的微生物属。

（C）分离株草图基因组中基因的功能注释。纵轴表示可注释基因所编码的功能，横轴表示编码某一特定功能的基因所占百分比。

我们将这些基因组与中国肠道微生物参考（CGMR）数据集进行了比较，发现在95%的平均核苷酸同一性（ANI）阈值下，所有基因组均与CGMR的MAGs匹配（表S9）。其中涵盖了来自6个门、26个属的69个物种（图3B；表S9），以及本研究中代表新鉴定物种的2个分离株。值得注意的是，这些分离株中有许多属于益生菌种，如双歧杆菌属（Bifidobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜酸乳杆菌属（Lacticaseibacillus）物种，以及潜在的下一代益生菌，包括拟杆菌属（Bacteroides）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和梭菌属（Clostridium）物种（图3B；表S9）。

我们运用标准工具对这些分离株的基因组进行注释，共鉴定出3501359个基因片段，这些片段不一定是已注释的完整基因。其中，12700个基因得到了独特注释，即便某个基因在多个物种中出现，也仅计数一次。约41%的已鉴定基因功能未知，而已注释基因涵盖了广泛的功能，包括维生素和多种药物转运、DNA拓扑结构调节，以及胆汁酸、氨基酸和短链脂肪酸（SCFAs）的生物合成（图3C；表S10）。这些研究结果表明，我们所收集的样本扩充了人类肠道中可培养微生物的分类多样性，为靶向机制验证提供了有价值的活体分离株。

肠道粪便杆菌可能对便秘产生影响

便秘是一种慢性肠道疾病，其成因多样，涵盖生活方式、心理及行为等诸多因素。在此，我们观察到17个宏基因组组装基因组（MAGs）的流行率与排便频率之间存在显著关联（错误发现率 [FDR]

图4 | 肠道粪便杆菌分离株缓解便秘

（A）携带与未携带肠道粪便杆菌（F. intestinalis）宏基因组组装基因组（MAG）的参与者之间排便频率差异。每个点代表一名个体，小提琴图展示了每周排便频率的分布情况。采用斯皮尔曼检验评估两组之间的差异。

（B）各组之间肠道传输时间的差异。

（C）各组之间小肠传输的差异。

（D）各组之间5小时粪便排出量的差异。

（E）各组之间胃动素水平的差异。

（F）各组之间血管活性肠肽（VIP）水平的差异。

（G）各组之间生长抑素（SS）水平的差异。

（H）各组之间丙酸水平的差异。

（B-D）每个点代表一个样本，并根据组别以不同颜色标记。箱线图展示了相应特征水平的中位数、第一四分位数和第三四分位数。上下须线分别延伸至不超过1.5倍四分位距（IQR）的最大值和最小值。异常值单独绘制。

（E-H）柱状图表示各组内特征的平均水平，误差棒表示标准差。采用 Wilcoxon 检验评估组间差异，并给出相应的p值。

与对照组（CON）相比，经洛哌丁胺（LOP）处理的小鼠表现出典型的便秘症状。这从全肠道转运时间延长（p=1.0×10⁻²；图4B）、小肠转运减慢（p=1.5×10⁻²；图4C）以及粪便排出量减少（p=2.9×10⁻²；图4D）中可明显看出。重要的是，与LOP组相比，灌胃给予肠道粪便杆菌分离株F1和F2以及动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12，可显著缩短全肠道转运时间（p

以往研究表明，胃动素和血管活性肠肽与肠道运动相关。另外，观察发现丙酸、乙酸和丁酸等短链脂肪酸（SCFAs）与便秘呈负相关。我们发现，灌胃给予肠道粪便杆菌分离株F1和F2以及动物双歧杆菌乳酸亚种BB-12，可显著提高胃动素、血管活性肠肽（VIP）和生长抑素（SS）的水平（图4E-4G）。此外，与CON组相比，肠道粪便杆菌F1和F2组的丙酸水平更高（图4H）。这些研究结果初步证明，使用肠道粪便杆菌可能对便秘具有有益作用。

与体重指数相关的脆弱拟杆菌可能对肥胖产生影响

除了便秘，我们还观察到脆弱拟杆菌A（B. fragilis_A）的流行率与宿主被归类为肥胖的体重指数（BMI）之间呈负相关（p=1.9×10⁻⁴；图5A），这表明脆弱拟杆菌A可能在肥胖方面具有潜在的有益作用。我们从1376个分离株中选取了三株脆弱拟杆菌A（B6、B7和B8），对喂食高脂肪饮食（HFD）的小鼠进行给药处理，同时以有前景成为下一代益生菌的脆弱拟杆菌ATCC25285（BATCC；图S6）作为参照组。

图5 | 脆弱拟杆菌A分离株对肥胖的影响

（A）携带与未携带脆弱拟杆菌A（B. fragilis_A）宏基因组组装基因组（MAG）的参与者之间体重指数（BMI）的差异。每个点代表一名个体，带点箱线图表示BMI的分布情况。使用斯皮尔曼检验评估两组之间的差异。

（B）6周内各组之间体重变化的差异。

（C）各组之间15分钟口服葡萄糖耐量试验（OGTT）血糖水平的差异。

（D）各组之间瘦素水平的差异。

（A、C和D）每个点代表一个样本，根据组别以不同颜色区分。箱线图展示了相应特征水平的中位数、第一四分位数和第三四分位数。上下须线分别延伸至不超过1.5倍四分位距（IQR）的最大值和最小值。异常值单独绘制。

（B-D）使用 Wilcoxon 检验显示组间差异，并给出相应的p值。

（E）与高脂饮食（HFD）组相比，差异代谢物的数量。x轴表示通过Wilcoxon检验在错误发现率FDR

（F）各组之间差异代谢物的重叠情况。

喂养6周后，我们观察到，与喂食普通饲料的对照组相比，喂食高脂肪饮食（HFD）的小鼠在第4-6周体重显著增加（p

为了解这些分离株在影响宿主心脏代谢特征方面的功能作用，我们对结肠粪便的代谢组进行了分析，结果显示，在对照组和HFD组之间的1437种代谢物中，有428种存在显著差异（错误发现率 [FDR]

我们进一步探究了这四种分离株所改变的差异代谢物，能否在体外利用肠道微生物群培养基（GMM）进行发酵时重现。值得注意的是，258种差异代谢物中有58种可在体外发酵中检测到，其中41种在空白GMM与添加四种分离株的培养基之间也表现出差异（p

来自新物种的分离株对无菌小鼠脂质代谢的调节作用

我们从两个新物种中获得了活体分离株：副拟杆菌属（FGD16K12）和乳杆菌属（FHNXY56M7），分别将其称为副拟杆菌新种（Parabacteroides sp. Nov）和乳杆菌新种（Lactobacillus sp. Nov）。尽管我们未观察到这两个新的宏基因组组装基因组（MAGs）的流行率与宿主表型之间存在任何显著关联，但我们探究了它们在宿主代谢健康方面的潜在作用。无菌小鼠通常用于研究单个细菌菌株对宿主生理功能的影响，并且在灌胃后的不同时间点进行平板计数，以此确定细菌的定植状态。为此，我们选用了属于相似属的两个分离株（狄氏副拟杆菌 [Parabacteroides distasonis] FSDTAHCMXY12和卷曲乳杆菌[Lactobacillus crispatus] JCM2009）进行比较。我们利用无菌小鼠开展了单一定植实验（图S8）。灌胃4天后，收集新鲜粪便样本，并在灌胃后第1天、第5天和第10天进行平板培养，以观察无菌小鼠模型中分离株的存在情况（图6A）。同时，分别采集血液和结肠组织，用于测量代谢物和基因表达。

图6 | 副拟杆菌属和乳杆菌属的分离株调节脂质代谢

（A）两种副拟杆菌属和两种乳杆菌属分离株的单一定植情况。线条表示不同天数定殖的细菌数量，灰色区域表示标准差。

（B）各组之间低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平的差异。

（C）各组之间甘油三酯（TG）水平的差异。

（D）副拟杆菌属分离株诱导的胆汁酸差异。

（E）乳杆菌属分离株诱导的胆汁酸差异。

（F）副拟杆菌新种中潜在胆汁酸代谢基因baiA编码的蛋白质结构比较。

（G）乳杆菌新种中潜在胆汁酸代谢基因cbh编码的蛋白质结构比较。

（F和G）蛋白质结构预测基于AlphaFold2进行。然后使用PyMOL将所得蛋白质结构（蓝色）与已确认的胆汁酸代谢蛋白质（紫色）进行比较。计算均方根偏差（RMSD）值以评估建模蛋白质与已确认蛋白质之间的结构相似性。

（H）乳杆菌新种结肠组织中差异基因的功能富集情况。纵轴表示差异基因的富集功能，横轴表示校正后的p值。

（I）胆汁酸代谢途径中关键基因的相对表达。

（B-E和I）每个点代表一个样本，根据组别以不同颜色区分。箱线图展示了相应特征水平的中位数、第一四分位数和第三四分位数。上下须线分别延伸至不超过1.5倍四分位距（IQR）的最大值和最小值。异常值单独绘制。使用Wilcoxon检验显示组间差异，并给出相应的p值。

对于血清代谢组，我们分别在接受副拟杆菌新种和乳杆菌新种处理的小鼠中鉴定出41种和155种差异代谢物（表S15）。值得注意的是，根据人类代谢组数据库（HMDB）和脂质图谱（LipidMaps）的注释，这些代谢物中分别有11种和69种被归类为脂质（表S15）。这些发现部分与两组小鼠中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总甘油三酯（TG）水平的差异相符（图6B和6C）。狄氏副拟杆菌FSDTAHCMXY12和卷曲乳杆菌JCM2009分别与副拟杆菌新种和乳杆菌新种属于同一属。将处理组小鼠与对照组进行比较，我们观察到在调节宿主代谢方面呈现相同趋势，且不同物种间的调节变化具有可预测性（图6B-6E；表S15）。

肠道微生物有可能通过多种分子（如次级胆汁酸）影响宿主脂质代谢。与对照组相比，我们观察到接受副拟杆菌新种处理的小鼠体内脱氧胆酸（DCA）和7-酮基石胆酸（7-KLA）水平较高，而接受乳杆菌新种处理的小鼠体内石胆酸（LCA）和甘氨石胆酸（GLCA）水平较高（错误发现率 [FDR]

胆汁酸通过激活核受体来调节脂质代谢，这些核受体包括法尼醇X受体（FXR）、维生素D受体（VDR）和孕烷X受体（PXR）。在转录水平上，我们分别在副拟杆菌新种组和乳杆菌新种组的结肠组织中，观察到253个和532个基因的差异表达（p2；表S16）。对差异表达基因的功能富集分析共得到28条富集通路，其中几条与胆汁酸代谢相关，例如乳杆菌新种组中的核雌激素受体结合（GO:0030331）和核类视黄醇X受体结合（GO:0046965）（表S17；图6H）。雌激素通过胰岛素/磷酸肌醇-3激酶信号通路调节CYP7B1的表达，而类视黄醇X受体（RXR）作为视黄酸受体（RAR）/RXR异二聚体的一部分，调节牛磺胆酸钠协同转运多肽（NTCP）的表达。RXR抑制NTCP，同时通过上调FXR诱导胆汁酸外排入胆汁。我们在副拟杆菌新种组中未观察到明显的功能富集。

我们分析了参与胆汁酸代谢的基因表达情况，包括经典合成途径中的关键基因（Cyp27a1），以及胆汁酸受体FXR、PXR和VDR。有趣的是，在这两个接受新分离株处理的组中，所有这些基因均呈现上调（图6I）。此外，还观察到编码酶、转运蛋白和转录因子的其他潜在胆汁酸相关基因存在显著差异（图S9；表S16）。在胆汁酸代谢方面，我们观察到相似的趋势（图6I；表S16）。总体而言，我们的数据表明，来自这些新物种的分离株可能通过次级胆汁酸调节脂质代谢。

讨论Discussion

全球人类肠道中存在一些常见的优势微生物物种，但不同人群间这些物种可能存在显著的遗传变异，这凸显了理解特定人群微生物菌株在微生物组相关疾病表型中作用的必要性。然而，对中国人群肠道微生物组遗传图谱的系统性研究仍然有限。在此，我们展示了一个全面的集合，该集合包含从中国全国范围内收集的3234份粪便样本中获得的101060个高质量宏基因组组装基因组（MAGs），代表了3707个非冗余物种。这个集合被称为中国肠道微生物参考（CGMR）数据集，使我们能够描绘肠道微生物组的地理特异性和生态特征。此外，我们使用27种培养基分离出1376株活体菌株，并将它们的MAGs与全基因组测序数据进行匹配。这一资源让我们能够初步对观察到的MAGs与表型之间的关联进行功能验证。

微生物基因组的大规模构建主要集中在欧洲裔个体的样本上。为了扩充当前的微生物参考基因组，我们将中国数据集与近期报道的大型微生物基因组数据集进行了比较，这些数据集包括CIBIO、UHGG、WIS、ELGG、IMGG和GTDB。我们识别出987个新的物种水平代表性MAGs，并将其添加到现有参考基因组中。这有助于更全面、多样地呈现微生物基因组，尤其是在非欧洲人群中。

通过对肠道微生物共现网络的分析，我们发现了独特的共生物种的存在，其中包括潜在的益生菌种，如嗜黏蛋白阿克曼菌（A. muciniphila）、肠道粪便杆菌（F. intestinalis）、长双歧杆菌（B. longum）和假链状双歧杆菌（B. pseudocatenulatum）。值得注意的是，这些物种在欧洲裔个体中并不常见。

地区特异性的MAGs表明，中国不同地区的肠道微生物群组成存在差异。值得注意的是，除华东地区外，每个地区都有其独特的MAGs集合，这至少部分归因于华东地区发达的经济和较高的人口流动性。特别有趣的是，观察发现中国东北地区拥有数量最多的独特物种，这可能受到该地区特定气候环境的影响。值得一提的是，这些物种中有一半属于毛螺菌科。毛螺菌科细菌是肠道共生菌，能为宿主产生有益的代谢产物，如短链脂肪酸（SCFAs）。中国东北地区独特的地理位置（东经118°-135°，北纬48°-55°）使其形成温带大陆性气候，该气候受来自西伯利亚冷空气的影响。该地区冬季漫长寒冷，夏季短暂多雨。有趣的是，研究表明毛螺菌科的丰度可能受温度和（或）风速的影响。这或许可以解释毛螺菌科细菌在中国东北地区人群中普遍存在的原因。这些研究结果突出了地理因素对塑造中国不同地区肠道微生物群多样性和组成的影响。

本研究涵盖了不同年龄组的参与者，其中占比最高的年龄区间为50-60岁。研究人群中还包括10%的婴幼儿（3岁以下）以及5.8%的84岁以上个体。相关性分析显示，有162个MAGs可能与年龄存在关联。此外，我们还观察到MAGs与包括排便频率和体重指数（BMI）在内的29种表型相关。

为初步探究MAGs与表型之间的关联，我们分离出细菌，获得了1376个分离株，其中包括两个此前未被鉴定的物种，分别隶属于副拟杆菌属（Parabacteroides）和乳杆菌属（Lactobacillus）。通过小鼠模型实验，我们得到的结果表明，肠道粪便杆菌（F. intestinalis）分离株对缓解便秘具有益生作用，脆弱拟杆菌A（B. fragilis_A）分离株在肥胖方面有潜在作用，而副拟杆菌属和乳杆菌属物种的分离株则可能通过胆汁酸对宿主脂质代谢发挥功能。

综上所述，本研究不仅扩充了现有的微生物基因组及配对分离株资源库，还为其对宿主的益生作用提供了证据。这有助于从机制层面理解宿主与微生物的相互作用，为基于微生物组的个性化疗法的开发奠定了基础。

研究局限Limitations of the study

我们认识到本研究存在一些局限性。首先，尽管我们从30个省份收集了3000多个样本，但与中国庞大的人口基数相比，样本量仍然有限。其次，对常见微生物和共现微生物阈值的主观设定，可能会给观察结果带来偏差。因此，有必要开展进一步研究以解决这一问题。第三，尽管已识别出的区域特异性和疾病相关的MAGs具有潜在研究价值，但它们可能受到社会经济和健康状况等因素的影响，而这些因素在我们目前的研究中尚未收集。为验证这些发现，需要在特定临床环境下，通过前瞻性队列研究进行独立重复验证。第四，动物实验所得到的关于功能效应的结果仅为初步结论，还需要更深入的研究。最后，由于缺乏菌株特异性引物，我们无法准确评估单个菌株在肠道内的定植情况。进一步评估不同细菌菌株的定植能力，将有助于我们理解所观察到的它们对宿主产生的各种影响。

作者简介

翟齐啸(通讯作者)

翟齐啸，江南大学食品学院副院长、食品科学与资源挖掘全国重点实验室副主任，教授、博士生导师。主要从事益生菌理论与技术、肠道微生物功能挖掘及肠道菌群与功能食品相关研究，国家杰出青年基金、优秀青年基金及江苏省优秀青年基金获得者，入选农业农村部农业科研杰出人才、江苏特聘教授、联合国粮农组织（FAO）食品安全技术咨询专家、中国食品科学技术学会“杰出青年”。

近年来以第一或通讯作者在Cell Host & Microbe、Cell Genomics、PNAS等国际知名学术期刊发表SCI科研论文150篇，获中国授权专利60项，国际授权专利8项。负责主持包括国家自然科学基金联合基金重点、面上、青年，国家十四五重点研发计划课题等科研项目14项，荣获国家技术发明奖二等奖、中国专利奖金奖等国家与省部级奖励5项。担任中国食品科学技术学会益生菌分会副秘书长、常务委员，江苏省青年科技工作者协会理事等，《Food Science and Human Wellness》副主编，《Engineering》和《中国食品学报》编委等职务。指导学生获得江苏省研究生“大食物观”科研创新实践大赛一等奖、中国国际大学生创新大赛产业赛道银奖等奖励。

陈连民(通讯作者)

陈连民，博士，南京医科大学/江苏省人民医院教授，博导，国家海外优青，江苏卫生创新团队领军人才，江苏特聘医学专家。从事肠道微生物与宿主心血管代谢健康关系研究，前瞻性原发高血压队列eHypertension和肥胖减重队列PBS主要发起人之一。

近五年以通讯/第一作者在Cell (封面文章)，Nature Medicine，Circulation Research (封面亮点文章)，Cell Genomics (封面文章)，Nature Communications，The ISME Journal及Cell Reports (封面文章) 等期刊发表研究成果。主持国家自然科学基金优秀青年科学基金 (海外) 项目、重大项目课题、面上项目等8项，获荷兰Tekke Huizinga奖及授权专利3件，并担任Engineering，iMeta及Medicine in Microecology等期刊编委。

孔祥清(通讯作者)

孔祥清，男，1966年9月生，博士，教授，主任医师、博士生导师。现任中国生物医学工程学会介入医学分会副主任委员、中华医学会心血管病分会青年委员，中华医学会心血管病分会结构心脏病学组委员，江苏省心血管病分会副主任委员。江苏省六大高峰人才，江苏省兴卫工程医学重点人才、江苏省政府“333”工程培养对象。

1998年开始从事结构性心脏病介入治疗的临床应用和相关研究。1999年赴德国亚琛工业大学心血管专业学习，进行了结构性心脏病介入治疗器械生物相容性方面研究，研究论文发表在《Biomaterials》，获亚琛工业大学博士学位。同期还至荷兰Groningen大学进修生物材料研究技术。2001年回国后主要从事以下三方面工作：①结构性心脏病的介入治疗及临床随访研究，其中室间隔缺损介入治疗病例数居全国前列；②结构性心脏病缺损型病变分子致病机制研究；③介入治疗器械设计及器械生物相容性研究。先后主持国家“863”课题1项、国家自然基金3项、其他省、市级课题6项；发表通讯作者SCI论文5篇获得国家发明专利2项、实用新型专利3项；获江苏省科技进步三等奖1项，江苏省卫生厅新技术一等奖3项。

翻译：曾美尹，中国农科院基因组所，硕士在读

审核：朱志豪，广东医科大学，基因组所联合博士后

终审：刘永鑫，中国农科院基因组所，研究员/博导

排版：荀佳妮，中国农科院基因组所，生物信息学硕士在读

10月18-20日，微生物组-扩增子16S分析

11月15-17日，微生物组-宏基因组分析

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来源：微生物组