摘要：基于细胞片(CS)的方法具有巨大的组织再生潜力。与天然组织一样，ECM为细胞稳态和功能提供结构和生化支持。保持ECM完整性的有效保存策略对于增强基于CS的方法的治疗潜力至关重要。虽然冷冻保存和亚低温保存方法提供了潜在的解决方案，但它们对CS ECM结构的影响尚

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基于细胞片(CS)的方法具有巨大的组织再生潜力。与天然组织一样，ECM为细胞稳态和功能提供结构和生化支持。保持ECM完整性的有效保存策略对于增强基于CS的方法的治疗潜力至关重要。虽然冷冻保存和亚低温保存方法提供了潜在的解决方案，但它们对CS ECM结构的影响尚不完全清楚。

冷冻保存（Cryogenic Preservation）：指在极低温度下（通常低于-150°C）进行的保存方法，常使用液氮等介质。这种方法用于长期保存生物样本、细胞、组织等，以维持其活性和结构。

亚低温保存（Hypothermic Preservation）：指在低于常温但高于冰点的温度下（通常约4°C）进行的保存方法，广泛应用于器官移植、血液保存等领域，以减缓代谢过程，延长保存时间。

为此，来自葡萄牙米尼奥大学/葡萄牙科英布拉大学/葡萄牙圣若昂中心医院三家单位的学者对hASCs CS（人类脂肪基质细胞细胞片）在低温保存和亚低温保存3天和7天后的ECM进行了全面分析。相关研究成果以“Cryogenic, but not hypothermic, preservation disrupts the extracellular matrix of cell sheets”为题于2024年12月25日发表在《Bioactive Materials》上。

1.亚低温维持蛋白质丰度模式

为了评估保存对ECM的影响，在保存前（BP）和保存后都进行了蛋白质组学分析（图1A）。首先，对脱细胞后获得的蛋白质组的组成进行表征。为了识别在CS蛋白质组中富集的特征，分析了亚低温保存（HP）或低温保存（CP）、3天（HP3或CP3）和7天（HP7或CP7）后蛋白质丰度相对于基线（BP）的差异（图1B）。从测试条件来看，低温保存3天的蛋白质丰度模式更接近保存前观察到的模式，表明改变最小。然而，在低温条件下长时间保存导致观察到的模式发生显著变化。无论保存时间如何，冷冻保存的CS的蛋白质丰度也发生了显著变化。对前50种表达蛋白进行无监督层次聚类分析，证实了BP和HP3之间蛋白质丰度模式的相似性，主要由橙色簇中的蛋白质给出（图1C）。为了识别富集特征，使用隔室数据集对不同簇中的蛋白质进行了注释（图1D）。富集特征表明与几个细胞隔室相关，尤其是所有簇中的质膜和粘附分子。橙色簇表现出最高的相关性，并突出了BP和HP3之间的相似性以及与其他组的差异。

图1 亚低温维持蛋白质丰度模式

2.差异表达蛋白质

通过相关性和差异表达分析进一步表征了蛋白质丰度模式。首先，相关性分析旨在阐明保存条件和蛋白质表达模式之间的关系（图2A）。具体来说，当比较CP3和CP7时，观察到强烈的正相关性（r = 0.7429），表明在低温保存条件下蛋白质丰度的模式是一致的。HP7和HP3表现出中等正相关性（r=0.4132），表明两个低温保存时间段之间的蛋白质丰度谱有一定程度的相似性。当比较不同的保存方法时，也观察到了正相关性，但其影响随着保存时间的增加而变化。具体来说，当比较HP3和CP3时，明显存在弱正相关性（r = 0.2739）。该分析旨在识别在所研究的实验条件下表现出统计学上显着丰度差异的蛋白质，使用保存前的水平- BP -作为基准（图2B）。与BP条件相比，使用低温保存不会产生任何显着的差异丰度。相反，HP3仅呈现出两种与BP相比具有差异丰度的蛋白质。在低温保存7天后，这个数字增加到四个。使用维恩图直观地表示差异表达蛋白质的重叠（图2C）。具体而言，在HP3和HP7样本中观察到两种蛋白质存在差异表达，另外两种蛋白质在HP7中存在差异表达。在这些蛋白质中，只有一种与ECM相关，即含有EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白2 (EFEMP2)。

图2 差异表达的蛋白质

3.所有测试的保存方法均能保留基质蛋白的丰度

为了揭示保存方案对ECM相关蛋白的潜在影响，作者探索了CS基质体。在已鉴定的1034种蛋白质中，根据人类基质体数据集，有86种被识别为ECM成分。共鉴定出46种核心基质体蛋白，包括6种蛋白聚糖、26种糖蛋白和14种胶原蛋白，以及40种ECM相关蛋白，包括4种分泌因子、11种ECM关联蛋白和25种ECM调节剂（图3A）。在检测到的胶原蛋白中，有各种纤维类型，例如I、III、V和XI型，以及非纤维类型，例如IV、VI、VIII、XII和XVI型。此外，在糖蛋白分类中鉴定出核心基质体的关键成分，例如纤连蛋白和层粘连蛋白。为了研究保存前后基质体蛋白质特征的变化，对ECM中发现的前50种蛋白质进行了无监督层次聚类分析（图3B）。分析显示，基线(BP)和HP3的基质体蛋白质模式更接近，而其余条件则聚集得更远，表明后者组的基质体蛋白质丰度变化更大（图3B）。鉴于核心基质体蛋白质的结构重要性，对每种条件下的丰度进行初步分析显示，这些条件之间没有统计学上的显着差异（图3C）。根据蛋白质类型细分核心基质体蛋白质时也是如此。

免疫组织化学分析（图3D）证实了这些发现，显示无论采用何种保存方法，保存前后关键ECM成分I型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白的蛋白质表达均无明显变化。然而，保存后观察到CS厚度的减少，表明由于保存过程导致ECM结构直接受损，而不是蛋白质丰度的变化（图3E）。

图3 细胞片基质体分析

4.冷冻保存会改变基质的组织和结构

在观察到保存后厚度的变化后，研究了CS的其他结构和机械变化。使用MT染色的组织学分析表明，在低温保存后，尤其是长时间保存后，ECM均匀性明显破坏，这与观察到的CS厚度减少一致（图4A）。在HP7条件下也观察到一定程度的ECM损伤，尽管不如低温条件那么严重。正如其他数据所表明的那样，与基线BP条件相比，HP3是更好地维持ECM结构的条件。使用共聚焦显微镜在快绿染色后对胶原蛋白结构进行更精细的分析，发现胶原蛋白均匀性出现碎裂和破坏，证实了上面观察到的宏观结构变化（图4B）。然而，当在纳米尺度上检查结构完整性时，不同条件之间没有观察到差异，这表明保存后的主要结构损伤发生在宏观而非纳米尺度上。

在亚低温条件下保存的CS保持了与BP状态相似的胶原结构组织，这进一步反映在通过BioAFM测量的机械性能中（图4C）。杨氏模量通过纳米压痕评估，其中探针压入样品表面以生成受力位移曲线。观察到的杨氏模量变化反映了细胞片成分的异质刚度：较软的细胞区域产生较低的模量值，而较硬、排列整齐的胶原纤维产生较高的值。在所有保存条件下，CS刚度与BP条件相比有所下降。然而，HP3和HP7条件均呈现出与BP条件相似的核密度分布频率，表明CS中较硬的组件保存得更好，与在低温下保存的CS形成鲜明对比（图4D）。

图4 冷冻保存会改变基质的组织和结构

综上，本研究全面深入地探讨了低温和亚低温保存对CS ECM成分及其结构和机械性能的影响。研究结果表明，暴露于低温会导致ECM结构发生显著变化，尤其是胶原蛋白组织的破坏。相反，亚低温保存对ECM结构的影响不太明显，CS在很大程度上保留了其原始结构完整性和机械性能。观察到的ECM结构变化对基于CS的疗法的临床实施具有重要意义。虽然没有发现ECM蛋白质丰度方面的显著变化，但低温保存后显著的ECM结构变化可能会影响CS的生理功能，从而影响其在临床上用作疗法时的功效。这表明亚低温可能是从制造现场到临床保持CS完整性和功能性的最佳选择。

来源：EngineeringForLife