摘要：脓毒症是导致死亡的主要原因，其成功治疗需要快速准确地识别致病病原体。许多病原体可导致血液感染（BSI），包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌和不动杆菌。血培养确认病原往往需要几天的时间；分子诊断方法，如实时多重聚合酶链反应，周转时间比血
脓毒症是导致死亡的主要原因，其成功治疗需要快速准确地识别致病病原体。许多病原体可导致血液感染（BSI），包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌和不动杆菌。血培养确认病原往往需要几天的时间；分子诊断方法，如实时多重聚合酶链反应，周转时间比血液培养短得多，并且具有高灵敏度和特异性。特别是，直接检测血液样本中的病原体的能力对于快速诊断至关重要。
血液样本中含有许多PCR抑制剂（如人类DNA和血红蛋白），以高产量和纯度分离和纯化DNA，对于提高分子诊断结果具有重要意义。近日，杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Comparison evaluation of bacterial DNA extraction methods for improved molecular diagnostic accuracy of sepsis-causing pathogens in clinical whole blood samples”的文章。本研究旨在比较不同细菌的提取方法，包括K-SL提取试剂盒和GraBon™与QIAamp DNA Blood Mini试剂盒的分子诊断准确性，考察其潜在优势和临床适用性。研究结果突出了基于磁珠的方法的优越性能，特别是在自动化的情况下。
图片来源：Scientific reports
主要内容
不同的DNA提取方法概述
DNA提取方法大致可分为煮沸裂解、柱纯化和磁珠纯化法，根据样品类型和实验目的的不同，每种方法都有自己的优点和局限性。基于柱纯化的提取方法，如QIAamp DNA血液迷你试剂盒（QIAGEN）被广泛使用，并且由于其高灵敏度而经常作为研究的基准。其他值得注意的产品包括AccuPrep基因组DNA提取试剂盒，以及GeneJET全血基因组DNA纯化迷你试剂盒。基于磁珠的提取方法因其易于自动化和能够产生高纯度DNA而受到关注。基于该技术，K-SL DNA提取试剂盒，用于从全血中提取细菌DNA，结合细菌分离技术，提高提取效率。GraBon™（是一个自动化平台，使用与K-SL DNA提取试剂盒相同的试剂，但采用机器人处理，以提高产量和一致性。
不同试剂盒对大肠杆菌诊断准确性的比较
使用特定引物进行实时PCR，作者测试了每种DNA提取方法对全血样品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的诊断敏感性、特异性和准确性。对于大肠杆菌，K-SL DNA提取试剂盒（77.5%）和GraBon™（76.5%）比QIAamp DNA血液迷你试剂盒（65.0%）的准确性更高（如下表）。统计分析表明，两种方法与QIAamp DNA血液迷你试剂盒的准确性差异有统计学意义。
不同试剂盒的比较。图片来源：Scientific reports
不同试剂盒
对金黄色葡萄球菌诊断准确性的比较
对于金黄色葡萄球菌，GraBon™以77.5%的准确率优于其他方法，而K-SL DNA提取试剂盒和QIAamp DNA血液迷你试剂盒的准确率均为67.5%（如上表）。三种方法之间的金黄色葡萄球菌检测准确率差异无统计学意义。
特异性
为了评估特异性，作者评估了20份阴性血培养样本和20份常规健康检查样本。所有三种提取方法在这些样品中的细菌检测结果一致为阴性，表明所有检测方法的特异性均为100%。
产生准确性差异的原因
K-SL 和GraBon™均显示出比QIAamp 更高的准确性。这可从细菌裂解过程的差异来解释。K-SL和GraBon™采用磁珠先从全血中分离细菌后进行裂解，为DNA提取提供更清洁的样品。QIAamp直接在全血中进行细菌裂解；细菌、血液蛋白、酶和其他成分一起处理，导致灵敏度和准确性较低。
革兰氏阳性金黄色葡萄球菌具有较厚的肽聚糖细胞壁，比革兰氏阴性大肠杆菌具有更大的抗裂解能力。GraBon系统采用了基于电机驱动的旋转塑料尖端，以产生剧烈的涡流，有助于提高提取DNA的效率。GraBon可以处理500µL的样品和100µL的洗脱液；K-SL和QIAamp处理200µL样品，分别洗脱100µL和200µL。这种差异使GraBon™实现更高的灵敏度，提高了低细菌负荷的检测，这对于败血症诊断等临床应用至关重要（见下表）。
不同细菌DNA提取方法描述。图片来源：Scientific reports
总结与讨论
在本研究中，作者评估了三种DNA提取方法（QIAamp DNA Blood Mini Kit、K-SL DNA extraction Kit和GraBon™）对WB中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测性能。结果表明，在性能上存在显著差异，特别是在从全血中提取细菌DNA的能力方面。
此研究有几个明显的局限性。只关注革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中的一种，可能不能完全代表临床环境中遇到的细菌病原体的多样性。这些局限性强调了未来研究需要更大的样本量和更多样化的细菌种类，以提供临床微生物学中更全面的提取方法评估。
尽管存在这些局限性，但本研究为WB样品中细菌检测的不同DNA提取方法的性能提供了有价值的见解。这一发现突出了基于磁珠的方法的优势，特别是在自动化的情况下。K-SL DNA提取试剂盒和GraBon™在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测中表现出优异的性能，强调了在分子诊断中选择合适的方法的重要性。这些结果对临床微生物学，特别是对全血样品中BSI的快速准确检测具有重要意义。
来源：小桔灯网
