摘要：肝癌是全球范围内一项重大的健康挑战，其发病率正在不断上升。肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，约占所有肝癌病例的90%。HCC的治疗面临着复发率高、生存期短等难题，而现有的治疗手段效果并不理想。因此，迫切需要深入研究驱动HCC进展的分子机制，以便发现

肝癌是全球范围内一项重大的健康挑战，其发病率正在不断上升。肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌中最常见的类型，约占所有肝癌病例的90%。HCC的治疗面临着复发率高、生存期短等难题，而现有的治疗手段效果并不理想。因此，迫切需要深入研究驱动HCC进展的分子机制，以便发现新的诊断标志物和药物靶点。

之前的研究发现，HCC中的胆固醇稳态受到严重破坏。NPC1（尼曼匹克病C型蛋白1）是一种与胆固醇转运相关的蛋白质，在HCC中具有较高的预后风险评分。作为一种大的跨膜蛋白，NPC1主要定位在晚期内体/溶酶体膜上，被认为与胆固醇代谢和病毒感染（如埃博拉病毒）相关。不过，它在HCC中的确切作用仍不清楚。

近日，国家蛋白质科学中心（北京）姜颖课题组与贺福初院士团队利用基因敲除（KO）小鼠模型阐明了NPC1在HCC发生和发展中的作用。他们发现，NPC1通过控制TGFBR1蛋白的稳定性来调控TGF-β通路，进而促进HCC进展，而这种机制与胆固醇转运无关。这项成果发表在《Nature Communications》杂志上，提出了以NPC1为靶点的HCC治疗策略。

研究材料与方法

在这项研究中，研究人员使用了多个小鼠模型来研究NPC1的作用，包括小鼠皮下肿瘤模型和尾静脉转移模型以及DEN/CCl4诱导的HCC模型（CreAlbNpc1F/F和Npc1F/F小鼠由赛业生物提供）。他们还构建了他莫昔芬诱导的肝特异性Npc1基因敲除小鼠模型和MYC驱动的自发HCC小鼠模型。他们使用了过表达NPC1和稳定敲降NPC1的多个HCC细胞系，并开展了细胞增殖、迁移和侵袭分析。此外，他们还通过环己酰亚胺追踪实验和泛素化分析来检测TGFBR1蛋白的稳定性。

技术路线

通过体外和体内实验评估NPC1在HCC中的功能

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通过蛋白质组学等分析探索NPC1促进HCC进展的机制，
以及是否与胆固醇转运功能相关

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探索NPC1对TGFBR1蛋白稳定性的影响，
以及NPC1通过何种机制影响TGFBR1蛋白的稳定性

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通过多个小鼠模型来验证NPC1在调控TGF-β通路和HCC进展中的作用

研究结果

NPC1促进了HCC进展

研究人员首先分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据集，发现在52%的癌症类型（包括HCC）中，NPC1在肿瘤组织中显著上调。与癌旁组织相比，NPC1在HCC组织中的蛋白和mRNA水平均显著升高。NPC1高表达患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）明显低于NPC1低表达患者。这些结果显示，NPC1在HCC中发挥关键作用。

接下来，研究人员通过体外和体内实验对NPC1在HCC中的功能进行了评估。他们使用了过表达NPC1的PLC/PRF/5细胞以及敲降NPC1的HepG2和MHCC-97H细胞。他们发现，NPC1过表达显著增强了细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而NPC1的沉默则显著降低了这些能力。在回补NPC1后，这两种细胞系的增殖、迁移和侵袭能力几乎完全恢复。

为了进一步探讨NPC1在肿瘤生长和转移中的作用，他们采用了小鼠皮下肿瘤模型和尾静脉转移模型。在皮下瘤模型中，NPC1基因敲降导致肿瘤大小和重量显著减少；在尾静脉转移模型中，NPC1基因敲降导致肺部肿瘤转移显著减少，进一步证明了它在肿瘤转移中的关键作用。这些结果显示，NPC1是促进HCC进展的关键因子。

NPC1以不依赖胆固醇转运的方式调控TGF-β通路

为了探究NPC1促进HCC进展的机制，研究人员对敲降NPC1的PLC/PRF/5和HepG2细胞进行了蛋白质组学分析。通路富集分析表明，NPC1敲降显著抑制了HCC细胞中的TGF-β通路激活，并导致TGFBR1、p-SMAD2和p-SMAD3蛋白水平下降（图1）。从功能上讲，敲降NPC1降低了HCC细胞的迁移能力（图1）。这些结果表明，NPC1在促进HCC转移的过程中主要调控了SMAD2/3的激活。

值得注意的是，在敲降NPC1后，回补NPC1的P691S突变体（胆固醇转运活性缺失）仍能恢复TGFBR1和p-SMAD2的水平以及细胞迁移能力（图1），表明NPC1调控TGF-β通路的方式与其胆固醇转运功能无关。

图1. NPC1以不依赖胆固醇转运的方式调控TGF-β通路

NPC1增加TGFBR1蛋白的稳定性并抑制其泛素化

后续的环己酰亚胺追踪实验表明，NPC1在HCC细胞中的过表达延长了TGFBR1的半衰期，而NPC1的敲降则加速了TGFBR1的降解，强调NPC1在稳定TGFBR1蛋白水平中发挥作用。利用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，他们发现TGFBR1蛋白水平显著增加，表明NPC1对TGFBR1降解的调控是由蛋白酶体介导的。此外，NPC1降低了Lys 48连接的多泛素化水平，而这种泛素化与蛋白酶体降解相关。这些数据表明，NPC1通过抑制Lys 48连接的泛素化，减少了TGFBR1的蛋白酶体降解，进而稳定了TGFBR1。

通过免疫共沉淀实验和细胞共定位分析，研究人员证实了NPC1与TGFBR1存在相互作用，且TGFBR1-NPC1复合物主要存在于溶酶体中（图2）。进一步分析表明，NPC1上的氨基酸692-854区域负责与TGFBR1结合。在稳定敲降NPC1的HCC细胞中，回补NPC1（P691S）可恢复TGFBR1表达和细胞迁移，但回补NPC1（Δ692-854）则无法挽救这些表型（图2）。

他们推测NPC1可能通过调节TGFBR1与SMAD7或E3连接酶的相互作用来抑制其泛素化。后续实验证实了这一点，NPC1过表达减少了TGFBR1与SMAD7及E3泛素酶SMURF1/2的相互作用（图2）。这些结果表明，NPC1通过与TGFBR1相互作用并抑制其与SMAD7和SMURF1/2的结合，保护TGFBR1免受蛋白酶体降解。

图2. NPC1与TGFBR1相互作用并抑制其与SMAD7/SMURF的结合

通过对286对人类HCC组织样本的检测，研究人员发现NPC1与TGFBR1的表达之间存在明显的正相关。为了探索NPC1是否通过TGFBR1激活来促进HCC进展，他们利用TGFBR1抑制剂（LY2157299）来处理过表达NPC1的PLC/PRF/5细胞。这种处理可明显减弱NPC1诱导的细胞迁移增强。此外，在小鼠尾静脉转移模型中，过表达TGFBR1挽救了NPC1敲降细胞的转移潜力。这些结果表明，TGFBR1对NPC1介导的促进HCC进展至关重要。

肝脏NPC1缺失抑制TGF-β信号传导并限制HCC进展

最后，研究人员还委托赛业生物构建了肝特异性的Npc1条件性基因敲除小鼠（CreAlbNpc1F/F）和对照小鼠（Npc1F/F），并通过DEN-CCl4诱导了HCC模型。他们发现，在注射DEN 24周后，对照组小鼠出现了巨大的肝脏肿瘤，而CreAlbNpc1F/F小鼠的肿瘤大小和数量均明显下降（图3）。在MYC驱动的自发HCC小鼠模型以及他莫昔芬诱导的Npc1基因敲除小鼠模型中，他们获得了类似的结果。

染色结果显示，CreAlbNpc1F/F小鼠肿瘤中的侵袭性标志物减少。更重要的是，Npc1基因敲除导致TGFBR1及其下游效应物p-SMAD2的表达减少，这也印证了NPC1在调控TGF-β信号通路中的作用。同时，CreAlbNpc1F/F小鼠的生存时间延长。这些结果有力地证明了NPC1在调控TGF-β通路和促进HCC进展中的作用，突出了NPC1的治疗潜力。

图3. 肝脏NPC1缺失抑制HCC肿瘤发生和进展

结论

图4. NPC1调控TGF-β信号通路的示意图

这项研究利用肝细胞中缺失Npc1的转基因小鼠模型，确定了NPC1在肝细胞癌中的促肿瘤作用。NPC1与TGFBR1相互作用，阻碍其与SMAD7/SMURF复合物的结合，进而减少TGFBR1的泛素化。通过稳定TGFBR1蛋白，NPC1调控了TGF-β信号通路，并促进了癌症的进展和转移（图3），而这与其在胆固醇转运中的作用无关。这些结果不仅揭示了HCC进展背后的分子机制，也表明NPC1有望成为HCC的预后标志物和治疗靶点。

原文检索

Li, S., Yan, L., Li, C. et al. NPC1 controls TGFBR1 stability in a cholesterol transport-independent manner and promotes hepatocellular carcinoma progression. Nat Commun16, 439 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-024-55788-5

来源：老齐的科学大讲堂