在生命科学领域，蛋白质相互作用是调控细胞功能的核心机制之一。传统的检测方法存在操作复杂、假阳性率高、无法实时观察等局限。双分子荧光互补技术（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC） 应运而生！什么是双分子荧光互补实验呢？当两个不发光的荧光蛋白片段遇到特定的蛋白质并相互作用时—就好像钥匙和锁的完美匹配，此时便拥有了打开荧光大门的密码，使其发出黄色的荧光。通过观察实验结果是否产生荧光就可以判断蛋白是否发生了互作，让实验结果实现“可视化”。一、实验原理原理：双分子荧光互补实验（BiFC）的原理是将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段（N-fragment和C-fragment），然后将这两个荧光蛋白的片段分别融合到两个目标蛋白上。实验中需要设置Nyfp和cyfp的两个空载对照。摘要：在生命科学领域，蛋白质相互作用是调控细胞功能的核心机制之一。传统的检测方法存在操作复杂、假阳性率高、无法实时观察等局限。双分子荧光互补技术（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）应运而生！
三、实验流程-动植物体系双攻略01 哺乳动物细胞来源（以HEK293T为例）步骤：♦构建目标蛋白的BiFC载体（VN-A和VC-B）。♦将质粒共转染HEK293T细胞。♦37℃培养24-48小时后，通过共聚焦显微镜观察荧光信号。♦定量分析荧光强度（ImageJ或Flow Cytometry）。案例文献：最近在Nature Communications杂志发表了一篇题为《NOTCH1 mitochondria localization during heart development promotes mitochondrial metabolism and the endothelial-to-mesenchymal transition in mice》的文章。作者研究了 NOTCH1 胞内结构域 （NICD1） 在发育中的小鼠胎儿心脏线粒体中的作用。为了研究 NICD1 在线粒体中的潜在功能，通过质谱实验鉴定了 NICD1 相互作用蛋白，发现线粒体基质中的三种代谢酶与 NICD1 相互作用，即异柠檬酸脱氢酶 3B （IDH3B）、柠檬酸合酶 （CS） 和 PDHB，并在HEK293T 细胞中进行的 BIFC实验中证实了外源性 NICD1 与 PDHB 的相互作用。在双分子荧光互补 （BiFC） 检测中，当两个非荧光片段被两个相互作用的蛋白质聚集在一起时，就会产生荧光信号。为了消除分子量不均匀效应，将靶蛋白融合到 Venus 的 C 端或 N 端，并收获了 VN-PDHB、VC-PDHB、VN-NICD1 和 VC-NICD1。构建 VN-bJun 和 VC-bFos 作为阳性对照（图 2D）。共转染 VN-PDHB 和 VC-NICD1 后（反应 1，图2E） 或 VN-NICD1 和 VC-PDHB（反应 2，图2F） 表达载体进入 HEK293T 细胞中，在细胞核外观察到荧光信号，这与 bJun 和 bFos 互补产生的核荧光信号形成鲜明对比（阳性对照，图2G 这些结果表明 NICD1 与线粒体中的 PDHB 相互作用）。
植物来源（以烟草为例）
♦01.载体构建（1）A基因模板构建到VC155-21OV303_pC2300-mVYCE载体上测序验证（带有HA标签）（2）B基因模板构建到VN173-21OV302_pC1300-mVYNE载体中测序验证（带有myc标签）注：pCAMBIA1300-YFPn 与 pCAMBIA1300-YFPc，pCAMBIA1300-YFPn-DgnsLTP1 与 pCAMBIA1300-YFPc，以及 pCAMBIA1300-YFPc-DgPIP 用作阴性对照。BIFC 比例尺，20 μm.四、技术总结♦技术优势直观可视化：直观、灵敏、可实时动态观察活细胞内的蛋白互作，适用于动植物等多种体系！所研究的蛋白处于天然环境中并且能直观报道蛋白相互作用在细胞中的定位研究。高特异性：仅当两个目标蛋白接近（无需抗体：避免免疫荧光中交叉反应或背景干扰。操作简单：检测更加灵敏，实验数据易处理，只是检测荧光的有无，背景是否干净，不需要依赖于其他次级效应。多色兼容性：可同时检测多对互作（如YFP/CFP双色系统）。♦局限性不可逆性：荧光片段互补后难以解离，无法反映动态变化。假阳性风险：过表达或非特异性聚集可能产生荧光信号。对系统温度敏感：通常在30℃以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段的互补，这对细胞在生理条件下的蛋白相互作用带来不利因素。五、常见问题Q
1.为什么有些基因预测互作且在酵母双杂中显示互作，但BiFC结果显示无信号？
由于在酵母双杂实验中BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达，导致最后的实验结果出现假阳性。同时，BiFC实验中目的蛋白融合荧光片段可能会影响蛋白之间的互作，且不同外源基因的瞬时表达效率大不相同，出现假阴性结果，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
Q
2.在烟草BiFC中什么样的光才算有效光？
在制片过程中时，尽可能清理干净叶片表面的杂质，排除气泡；看显微镜时，激发光电压不能打得太高，烟草细胞的轮廓清晰可见，且分布均匀。
Q
3.荧光素酶互补实验和BiFC实验的区别是什么？
荧光素酶互补实验和BiFC实验原理相近，荧光素酶互补实验是借助荧光素酶催化荧光素的荧光进行验证，而BiFC实验是借助荧光蛋白能产生荧光来验证。
4.BiFC实验中实验温度不当对结果有什么影响？
原因：温度对片段间互补影响很大。
对策1：在室温或低于室温（≤）下培养细菌或细胞
对策2：在生理条件下培养细菌或细胞，使融合蛋白正常表达，然后将培养物低温处理1至2h或接着室温培养1d。
通常使用GFP (Green Fluorescent Protein)标签蛋白 或者RFP (Red Fluorescent Protein)标签蛋白，但不同类型和种类的蛋白质可能需要不同类型的荧光蛋白来实现更好的检测和观察。需要具体的蛋白具体分析。
双荧光素酶实验在生命科学研究中发挥着重要的作用，为解决更多生物学难题提供了强有力的技术支撑。武汉金开瑞能够提供包括双荧光素酶实验、荧光素酶蛋白互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BIFC）等技术服务，从方案流程设计到技术试验执行，从科研技术服务到成品试剂盒提供，金开瑞实验平台满足您的一切需求，期待与您一起携手合作。
参考文献：
[1]ang J, Zhao R, Xu S, Zhou XY, Cai K, Chen YL, Zhou ZY, Sun X, Shi Y, Wang F, Gui YH, Tao H, Zhao JY. NOTCH1 mitochondria localization during heart development promotes mitochondrial metabolism and the endothelial-to-mesenchymal transition in mice. Nat Commun. 2024 Nov 16;15(1):9945. doi: 10.1038/s41467-024-54407-7.
[2]袁猛, 许纯珏. (2018). 烟草体系BiFC. Bio-101: e1010133. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010133.[3]Xiaoqin Liao, Xingsu Zhang, Xin Li, Yuchen Tian, Qing Yang, Yongyan Wang, Si Tang, Xuanling Luo, Fan Zhang, Lei Zhang, Beibei Jiang, Qinglin Liu, Lysine malonylation of DgnsLIPID TRANSFER PROTEIN1 at the K81 site improves cold resistance in chrysanthemum, Plant Physiology, Volume 192, Issue 4, August 2023, Pages 3152–3169, https://doi.org/10.1093/plphys/kiad285来源：金开瑞生物