摘要：Western Blot（WB）检测磷酸化蛋白是研究信号通路的核心实验，但因其高难度、低成功率被戏称为“实验人的噩梦”。本文从样本处理到抗体选择，总结磷酸化蛋白检测的关键难点与破解方案，助你轻松拿下实验结果！
Western Blot（WB）检测磷酸化蛋白是研究信号通路的核心实验，但因其高难度、低成功率被戏称为“实验人的噩梦”。本文从样本处理到抗体选择，总结磷酸化蛋白检测的关键难点与破解方案，助你轻松拿下实验结果！
一、为什么磷酸化蛋白检测难？
磷酸化修饰动态变化磷酸化状态受激酶/磷酸酶调控，样本处理稍有延迟或温度波动，修饰位点可能丢失。丰度极低磷酸化蛋白占总蛋白比例常低于1%，需超高灵敏度抗体和优化曝光条件。抗体特异性要求严苛不同磷酸化位点（如p-AKT Ser473 vs Thr308）需严格对应的抗体，交叉反应易导致假阳性。二、磷酸化蛋白检测避坑指南
1. 样本制备：锁住磷酸化状态
关键操作：使用新鲜样本，全程冰上操作，裂解液预冷并添加磷酸酶抑制剂（如Na3VO4、β-甘油磷酸）。组织样本离体后30秒内投入液氮，避免离体后信号衰减。2. 抗体选择：特异性决定成败
必做验证：验证抗体是否识别目标磷酸化位点：通过肽段竞争实验或突变体对照（如非磷酸化位点突变）。优先选择经多物种验证的抗体（如博研生物p-ERK、p-STAT3抗体）。3. 实验条件优化
电泳与转膜：使用高分辨率凝胶（如10% SDS-PAGE），转膜后立即用丽春红染色确认蛋白转移完整性。封闭与洗涤：封闭液选择5% BSA（避免脱脂奶粉，可能含磷酸化蛋白干扰信号）。洗涤时增加TBS-T中NaCl浓度（0.5 M），减少非特异性结合。4. 信号增强技巧
使用ECL超敏发光液，适当延长曝光时间（但需避免过度曝光导致背景过高）。对低丰度靶点，可尝试信号放大系统（如生物素-链霉亲和素HRP）。三、常见问题与解决方案
无信号或信号弱
可能原因：样本磷酸化丢失、抗体失效、曝光时间不足。对策：添加新鲜磷酸酶抑制剂，更换抗体批次，延长曝光至30分钟。非特异性条带多
可能原因：抗体交叉反应、封闭不充分。对策：优化抗体稀释比例（建议1:500-1:2000），增加封闭时间至2小时。背景过高
可能原因：膜未彻底洗涤、ECL液过期。对策：每步洗涤5次×5分钟，现配现用ECL工作液。四、高特异性抗体：实验成功的核心
磷酸化蛋白检测对抗体要求极为严苛。博研生物推出限时福利，助力攻克实验难关：
666元即享6支抗体套装（3支一抗+3支二抗）
来源：xiaoxi小小