摘要：β-烟酰胺单核苷酸（NMN）因作为细胞内重要辅酶 NAD+的前体而备受关注。NAD+在能量代谢、DNA 修复和细胞衰老等过程中发挥关键作用，而 NMN 作为其直接前体，补充 NMN 已成为提升 NAD+水平的有效策略。
β-烟酰胺单核苷酸（NMN）因作为细胞内重要辅酶 NAD+的前体而备受关注。NAD+在能量代谢、DNA 修复和细胞衰老等过程中发挥关键作用，而 NMN 作为其直接前体，补充 NMN 已成为提升 NAD+水平的有效策略。
近期，江南大学张显团队一项题为“Protein Engineering and Dual-Module Optimization for Efficient NMN Production in E. coli”的研究在线发表于 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上，研究人员通过蛋白质工程和双模块优化技术，在大肠杆菌中成功实现了 NMN 的高效合成。
研究团队构建了一个创新的双模块反应系统，该系统可以直接利用尿苷和烟酰胺，通过多酶级联反应来合成 NMN。具体而言，模块 1 由烟酰胺核苷激酶（NRK）与 ATP 再生系统构成，它能够催化烟酰胺核苷（NR）合成 NMN，同时利用多聚磷酸实现 ATP 的再生，有效解决了酶促磷酸化过程中 ATP 大量消耗的问题；模块 2 则引入了嘧啶核苷磷酸化酶（PyNP），在 NRK 的协同催化作用下，以尿苷和烟酰胺合成 NMN。这两个模块紧密配合，形成了一条 NMN 的高效合成路径。
图 | 双模块反应系统中，从尿苷到 NMN 的两步酶促反应路径
其中，NRK 在整个反应系统中具有双重功能，既参与 NR 的磷酸化过程生成 NMN，又在 NR 的合成中发挥作用，但 NRK 稳定性较差，不利于反应持续进行，因此研究人员对 NRK 进行了进一步的改造。
通过运用蛋白质工程策略，并借助计算机辅助设计，研究人员对 NRK 进行了半理性设计改造。他们先通过分析蛋白质结构和进化保守性，筛选出 25 个潜在的突变位点。随后使用 FoldX 软件对这些位点进行虚拟饱和诱变。经过多轮筛选，最终获得稳定性提高近 4 倍的突变体 KlmNRKM4。
图|突变体 KlmNRK 显著优于野生型
数据表明，突变体 KlmNRKM4 在热稳定性和催化性能上有显著提升。与野生型相比，KlmNRKM4 的半衰期增加近 4 倍，在 50℃ 下处理 20 分钟后，仍能保持 83.5% 的相对活性；其催化效率也提高了 1.2 倍，对 NR 的亲和力也得到增强，有助于后续反应高效运行。通过分子动力学模拟和结构分析，研究人员进揭示了 KlmNRKM4 性能提升的内在机制，即突变位点（N90L/S155K/S205P）可以通过增强氢键网络、疏水相互作用以及局部刚性结构，有效稳定酶的动态构象。
除了对关键酶 NRK 进行改造，研究人员还对大肠杆菌的底盘细胞进行了优化。在大肠杆菌的内源性 NAD 循环过程中，存在一些代谢途径将产物 NMN 和底物 NR 转化为副产物，这极大地降低了 NMN 的产量。为解决这一问题，研究人员利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，敲除了 pncC、deoD、ushA 和 nadR 等相关基因。实验结果表明，随着敲除基因数量的增加，NR 的消耗速率在 6 小时后从 25.8% 显著降至 7.1%，NMN 的积累效率得到了明显提高。而当在敲除 4 个基因的大肠杆菌中过表达 pRSFduet-KlmNRKM4-Chppk 构建 NMN3 时，以 400 mM NR 为底物，NMN 的转化率高达 96%。
图 | 敲除 pncC 等基因后，NMN 积累效率得到了明显提高
此外，研究人员还对双模块的反应条件进行了全面优化。在模块 2 中，温度、pH 值、底盘细胞以及酶比例等因素都会对 NR 的产量产生影响。实验发现，45℃ 时 NR 产量最高；pH 值在 7-8 之间时，NR 产量达到峰值；敲除编码磷酸核糖基转移酶的 deoB 基因后，NR 产量进一步增加；当基于粗酶活性的酶比例（BsPynP:KlmNRKM4）为 1:2 时，NR 产量可提高到 72.5%。最终，研究人员将经过一系列优化后的模块 2 与模块 1 相结合，再次以尿苷为底物进行一锅法合成 NMN，在 300 mM 尿苷的条件下，NMN 的摩尔转化率达到 81.1%，成功实现了 NMN 的高效生物合成。
总之，这项研究整合了蛋白质工程、代谢工程和多酶级联策略，构建了高效经济的双模块系统。与传统合成方法相比，该系统摆脱了对昂贵底物 NR 的依赖，有效解决了 ATP 消耗高、酶稳定性不足以及宿主代谢干扰等关键问题，为 NMN 的工业化生产奠定了坚实基础。
参考文献：
1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c00043
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来源：生辉SciPhi