摘要：这是磷酸化位点鉴定中最常用也是最强大的技术。通过使用特定的酶（如胰蛋白酶）消化蛋白质，然后利用质谱仪分析产生的肽段，可以鉴定出磷酸化的氨基酸残基。质谱可以提供关于磷酸化位点位置以及磷酸化水平的定量信息。磷酸化肽的富集是这一步骤中的关键，通常通过亲和层析法（如钛

磷酸化位点鉴定的常见技术包括：

1、质谱分析（Mass Spectrometry, MS）

这是磷酸化位点鉴定中最常用也是最强大的技术。通过使用特定的酶（如胰蛋白酶）消化蛋白质，然后利用质谱仪分析产生的肽段，可以鉴定出磷酸化的氨基酸残基。质谱可以提供关于磷酸化位点位置以及磷酸化水平的定量信息。磷酸化肽的富集是这一步骤中的关键，通常通过亲和层析法（如钛柱层析）来实现。

2、磷酸化特异性抗体

使用特定于磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸或磷酸化酪氨酸的抗体进行免疫沉淀，可以富集特定磷酸化的蛋白质或肽段。然后，这些磷酸化蛋白质或肽段可以进一步通过质谱分析进行鉴定。

3、二维电泳（2D-PAGE）和西方印迹（Western Blot）

首先通过二维电泳分离蛋白质，然后使用特异性磷酸化抗体通过西方印迹法进行检测。这种方法可以用来鉴定特定蛋白质的磷酸化状态，但对于磷酸化位点的精确鉴定来说，其分辨率较低。

4、磷酸化依赖性酶切分析

某些酶的切割位点在磷酸化后会发生改变，通过这种变化可以间接推断磷酸化位点。这种方法相对较少使用，因为它依赖于特定条件下特定酶的特异性。

5、基于蛋白质组学的方法

结合使用多种蛋白质组学技术，如肽段富集、质谱分析和生物信息学工具，可以系统地鉴定蛋白质样本中的磷酸化位点。

来源：科学露西