摘要：蛋白残留检测是生物制药质量控制的关键环节，尤其在重组蛋白药物、单克隆抗体及疫苗生产中，残留宿主细胞蛋白（HCP）可能引发免疫原性风险。
蛋白残留检测是生物制药质量控制的关键环节，尤其在重组蛋白药物、单克隆抗体及疫苗生产中，残留宿主细胞蛋白（HCP）可能引发免疫原性风险。
文章综述了酶联免疫吸附法（ELISA）、Western Blot、质谱分析及毛细管电泳法等主流检测技术的原理、应用及局限性，并探讨了方法验证的关键参数与行业标准，以期为药物开发与质量控制提供参考。
PART/ 01 行规要求
以宿主细胞蛋白（HCPs）为例，HCPs残留是影响药物安全性的重要因素，微量HCP也可能导致患者产生免疫反应或降低药物疗效。因此，各国药典（如USP、EP）和监管机构（FDA、EMA）均对HCP残留限值提出严格要求。
美国食品药品监督管理局FDA
应使用高灵敏度的检测方法对HCP进行检测，残留量应低于检测限度。开展纯化工艺的清除验证研究，在上市申请前，应至少对3批注册批(如工艺验证批)进行定量检测，以证明纯化工艺的清除效果。纯化工艺发生变更时，需重新开展清楚验证研究。
欧洲药品管理局EMA
对于HCP，无论产品和生产系统如何，都必须进行残留 HCP的常规检测，并且使用适当的分析测定方法测定纯化的去除水平，批次之间的结果应保持一致并符合规定。
中国药典2020版
应采用类似正交组合的方法来评估制品纯度/杂质，并为制品相关的变异体建立单独和(或)总体的可接受的标准。质量控制中包括的工艺相关杂质的质量控制(如蛋白A、宿主细胞蛋白质、DNA、其他潜在的培养或纯化残留物等)通常在原液阶段进行。
PART/ 02 主要检测方法
A.酶联免疫吸附法（ELISA）
原理：基于抗原-抗体特异性结合，通过酶标二抗催化显色反应定量目标蛋白。
步骤：包被捕获抗体→封闭→加样→检测抗体→酶标二抗→底物显色→OD值测定。
优势：高灵敏度(ng/mL级)、高通量、操作标准化。
局限：依赖高质量抗体，可能受交叉反应干扰；无法区分单个蛋白组分。
应用：广泛用于商业化HCP检测试剂盒。
B.Western Blot
原理：通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜后利用抗体进行特异性检测。
优势：可提供分子量信息，验证ELISA结果的特异性。
局限：半定量、通量低、耗时较长。
应用：常作为ELISA的补充方法，用于目标蛋白鉴定。
C.质谱分析（LC-MS/MS）
原理：液相色谱分离后，高分辨质谱鉴定肽段序列，实现蛋白定性与定量。
优势：无需抗体、可检测未知蛋白、高特异性。
局限：设备成本高、数据分析复杂、灵敏度受样品预处理影响。
进展：SWATH-MS等数据非依赖采集技术（DIA）提升了检测覆盖范围。
D.毛细管电泳（CE）
原理：利用电场中蛋白迁移率差异实现分离检测。
优势：快速、低样品消耗、适合电荷异质性分析。
局限：灵敏度较低，多用于纯度分析而非痕量残留检测。
E.2D电泳
原理：蛋白质电荷差异和分子量差异为基础进行分离
优势：产品中的痕量HCP可以得到很好的分离。可以提供每个蛋白斑点的大致分子量和等电点。
不足：过量的目标蛋白可能掩盖HCP的点；不同蛋白的染色性质有所差异，因此只能作为半定量的方法；高度的技术依赖性，需要非常有经验的检测员及高精密的设备。
监管要求ELISA为多数药典推荐方法。研发阶段早期研发可使用质谱全面分析，商业化阶段以ELISA为主。样品类型复杂基质需结合多种方法降低假阳性风险。
PART/ 03 典型案例
实验室利用质谱分析（LC-MS/MS）以胰蛋白酶（Trypsin）为蛋白水解酶，通过还原酶解后，进样LCMS系统，分别测定蛋白的特殊肽段，定量分析样品中马肌红蛋白、细胞色素C和牛血清白蛋白（BSA）三种蛋白的残留量。
选择合适的定量离子/对，对上述三种蛋白进行专属性、灵敏度、线性、精密度和溶液稳定性进行考察，均符合分析方法验证的要求。
胰蛋白酶为蛋白酶的一种，是肽链内切酶，选择地水解蛋白质中所有的由赖氨酸(Lys)或(精氨酸)Arg的羧基所构成的肽键。酶水解的优点是专一性强，利用不同的水解酶可有专一的切点，在蛋白质的一级结构的测定上非常有用。
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参考文献 References
[1] USP Residual Host Cell Protein Measurement.
[2] Zhang et al. (2020). *mAbs*, 12(1), 1702262.
[3]FDA Guidance for Industry: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products.
来源：科学现场
