浙工大团队改造大肠杆菌，从头生物合成咖啡酸和绿原酸

摘要：咖啡酸和绿原酸作为植物中广泛存在的酚类化合物，近年来因其显著的生物活性备受关注。咖啡酸具有抗炎、抗病毒和抗氧化等多种功效，在医药、化妆品和食品保鲜领域应用前景广阔。而绿原酸作为咖啡和茶叶中的重要成分，则展现出抗糖尿病、抗癌和神经保护等特性，已成为营养保健品市场

咖啡酸和绿原酸作为植物中广泛存在的酚类化合物，近年来因其显著的生物活性备受关注。咖啡酸具有抗炎、抗病毒和抗氧化等多种功效，在医药、化妆品和食品保鲜领域应用前景广阔。而绿原酸作为咖啡和茶叶中的重要成分，则展现出抗糖尿病、抗癌和神经保护等特性，已成为营养保健品市场的明星成分。

然而，这两种化合物在传统生产方法却面临严峻挑战——植物提取法受限于原料含量低（绿原酸在咖啡豆中仅占 5-10% 干重），且分离纯化成本高昂；化学合成法则需使用强酸强碱和高温高压条件，环境友好性差。这些瓶颈严重制约了两种化合物的广泛应用。

近日，来自浙江工业大学的研究团队通过多层次的代谢工程策略，成功改造大肠杆菌，使其能够以葡萄糖为原料高效合成具有重要药用价值的咖啡酸（CA）和绿原酸（CGA）。这项研究以题为“De novo Biosynthesis of Caffeic Acid and Chlorogenic Acid in Escherichia coli via Enzyme Engineering and Pathway Engineering”发表于 ACS Synthetic Biology，为工业化生产高附加值植物代谢物提供了新思路。

图 | 展示了咖啡酸和绿原酸在大肠杆菌中的生物合成途径

首先，研究人员从基因资源挖掘入手。他们在众多微生物基因中寻找能高效催化合成咖啡酸的酪氨酸氨裂解酶（TAL）。经过在 NCBI 数据库中仔细筛选和分析，他们发现了来自台湾红酵母（ Rhodotorula taiwanensis）的TAL（RtTAL）蛋白表现出众，能够初步实现催化合成咖啡酸。为了进一步提升它的性能，研究人员运用蛋白质工程技术，对 RtTAL 进行定向进化改造并成功获得了突变体 RtTALT415M/Y458F，这个突变体的催化效率较野生型提升，有效解决了途径中的限速步骤。

图 | 通过定点突变和组合优化提升 TAL 酶活性，并采用多种不同基因编辑策略，最终获得高产菌株

大肠杆菌中的L-酪氨酸合成受到多种机制的严格调控。主要的调控元件包括两种反馈抑制敏感酶，分别由 aroG 和 tyrA 编码。基于此，通过共表达 RtTAL、hpaBC、aroGfbr 和 tyrAfbr，在大肠杆菌中构建了高效的 CA 生物合成途径。

通过敲除竞争路径基因 pheA 和调控基因 tyrR，并并过表达 aroGfbr 和 tyrAfbr。这些改造使得工程菌株 CA11 的咖啡酸产量达到 604.4 mg/L。

绿原酸是通过羟肉桂酰辅酶 A 奎宁酸羟肉桂酰转移酶（HQT）将奎宁酸与咖啡酰辅酶 A (CA-CoA) 酯化而合成的。CA 转化为 CA-CoA 由 4-香豆酸辅酶 A 连接酶（4CL2）介导。因此，研究人员采用了几个策略提升绿原酸产量。

首先，他们通过理性设计对 HQT 酶进行改造，筛选出关键突变位点 I168L，使酶活性显著提升 23.9%。在表达调控方面，团队巧妙地运用核糖体结合位点（RBS）工程技术，通过系统筛选 25 种不同强度的 RBS 序列，最终确定中强度 RBS3 与 4CL2 组合时效果最佳，使 CGA 产量提升 25.1%。此外，研究人员还发现增强前体物质的供应可以提高绿原酸产量。他们通过过表达 ydiB、aroB、aroF 和 tktA 等基因构建了菌株 CGA13，成功增强前体供应。