摘要：抗生素生产废水处理厂（AM-WWTP）主要针对化学污染物进行设计，其工艺可能无法去除甚至存在富集抗生素耐药病原体和抗生素耐药基因（ARG）的风险。该研究综合使用深度宏基因组测序、16S rRNA扩增子测序、qPCR和微生物分离培养技术，系统探究了来自β-内酰胺

抗生素生产废水处理过程富集抗生素抗性人畜共患病原菌Aeromonas veronii

研究论文

● 期刊：ISME (IF:10.8)

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● 第一作者：王星烁

● 通讯作者：陈则友（zeyou@nankai.edu.cn）

● 发表日期：2025-4-21

● 主要单位：南开大学

摘要

抗生素生产废水处理厂（AM-WWTP）主要针对化学污染物进行设计，其工艺可能无法去除甚至存在富集抗生素耐药病原体和抗生素耐药基因（ARG）的风险。该研究综合使用深度宏基因组测序、16S rRNA扩增子测序、qPCR和微生物分离培养技术，系统探究了来自β-内酰胺生产废水处理厂全流程中11个污水处理单元中的细菌群落和抗生素耐药组。结果发现细菌群落和抗生素抗性基因（ARG）组成因处理单元而异，但两者间显著相关。某些ARGs由同一细菌宿主携带或者通过可移动遗传元件在不同的宿主间转移，从而能够在整个污水处理过程中持续存在，进而随出水排出。特别地，该AM-WWTP虽然对传统化学污染物具有优异的去除效果，但在由进水到出水的处理过程中不断富集人畜共患抗生素耐药致病菌Aeromonas veronii（一种危害水产养殖和人类健康造成重大经济损失的新兴病原体）。该富集现象大概由于残留的β-内酰胺所施加的长期选择压力及A. veronii在泥水分离过程中对水环境的偏好性所致。这种富集导致该AM-WWTP中A. veronii 的相对丰度显著高于其他来源的全球水环境样品。此外，与该AM-WWTP中发现的A. veronii具有最近同源进化关系的基因组分离自污水处理厂周边的一位腹泻患者的粪便。这些发现阐明了AM-WWTP潜在的巨大公共卫生风险，强调其在富集和传播人畜共患抗生素耐药病原体方面存在未被关注的作用。提示我们在抗生素生产废水的处理中除了需要监测常规化学污染物之外，还需要加强对抗生素耐药病原体和ARG的监测，以避免在排放时造成抗生素耐药病原体释放到环境中，危害生态环境和人畜健康。

引言

细菌在抗生素暴露的选择压力下进化出抗生素耐药性，这是一种自然的进化现象。人类社会中抗生素的广泛使用加速了这一现象，对公共卫生构成重大威胁。抗生素在治疗细菌感染方面具有强大的效力，因此是不可或缺的社会资源。但抗生素生产是一种资源密集型产业，需要消耗大量的水资源。制取一吨抗生素会产生大约500-6500 m3的废水。全球每年生产10-20万吨抗生素，预计会产生0.5-13亿立方米的废水。抗生素生产废水具有有机物含量高、生物毒性大、抗生素残留浓度高等特点，通常需要进行深度处理如吸附、生物处理、膜工艺和高级氧化来去除污染物。然而，即使使用这些深度处理工艺，AM-WWTP的出水中仍然可能残留大量的抗生素耐药细菌（ARB）和抗生素耐药基因（ARG），对人类和其他动物构成重大健康威胁。因此，AM-WWTP为研究抗生素耐药性在多种连续污水处理单元的演变过程及其健康风险提供了独特的机会。

尽管几十年来AM-WWTP中的抗生素耐药性受到广泛关注，许多学者对这个问题进行了广泛的研究，但之前的研究并未系统分析AM-WWTP不同处理阶段中细菌群落、ARB和ARG的动态变化。由于样本量有限、低深度宏基因组测序（通常每个样本

结果与讨论

AM-WWTP中ARG和微生物群落的动态变化

对收集到的样品进行深度宏基因组测序，除进水样品因恶劣的生境导致DNA含量过低因而不足以完成测序外，其他各个样品均正常测序分析（图1a）。深度宏基因测序显示AM-WWTP中的ARG和微生物群落分布在不同的污水处理设施中存在差异，主要根据所使用的处理工艺进行聚类，可被划分为五个不同的组（图1b-1c)。普氏分析进一步揭示了ARG组成与细菌群落之间的显著相关性（图1d）。

图1 | AM-WWTP采样示意及其中ARG和微生物的结构组成

（a）污水处理流程及采样示意图;（b）不同处理单元间ARG组成的聚类分组;（c）不同处理单元间微生物群落的聚类分组；（d）ARG及微生物群落显著相关。

随着污水处理的进行，检测到的ARG种类和数量均呈下降趋势（图2a），表明污水处理工艺对ARG有一定的去除效果。其中，磺胺类和β-内酰胺类耐药基因是丰度最高的两种耐药基因类型（图2b），这与该处理厂污水中残留的主要药物类型和制药厂生产的主要药物类型相对应，表明药物残留所具有的潜在筛选对应ARG类型作用。对比不同环境发现该污水厂ARG的丰度水平显著高于其他环境（如土壤、底泥、河水、饮用水等），与畜禽粪便这一公认的ARG高丰度储存库相接近（图2c）。最后，发现不同处理单元由某一特定微生物主导（图2d），例如，Acinetobacter towneri在调节池（RT）中占主导地位，而Thauera aminoaromatica在微电解池（MER）中普遍存在，Rhodocyclale在第五组所属的处理单元保持高丰度。这可能是不同处理单元间ARG和细菌群落组成差异的最大原因。

图2 | AM-WWTP中ARG及细菌的动态变化

（a）ARG丰度（柱图）和种类（线图）的变化；（b）不同类型ARG的相对丰度；（c）与其他环境中ARG丰度的对比；（d）细菌在种水平分类的相对丰度。

水平基因转移在ARG存续中的重要作用

进行宏基因组组装并统计结果，发现某些微生物无法在污水处理过程中被去除而ARG可由这些宿主携带在处理过程中持留（图3a），而另一些ARG可由在其侧翼存在的可移动遗传元件携带在不同宿主间传播因而在处理过程中得以留存（图3b）。进一步的统计分析证明可移动遗传元件在ARG的存续中发挥重要作用（详见SI）。

图3 | AM-WWTP中ARG的不同残留策略

（a）aadA由Pseudomonas aeruginosa携带在污水处理过程中持留；（b）aph(6)-I由可移动遗传元件携带在不同宿主间传播而在污水处理过程中持留。

耐药致病菌Aeromonas veronii的富集

宏基因组Binning获得了226个携带ARG的宏基因组草图，其中有两个注释为Aeromonas veronii的基因组同时携带毒力因子且在处理过程中逐渐被富集（图4a）。A. veronii基因组注释到的一个ARG亚型OXA-12（β-内酰胺耐药基因）也在处理过程中被不断富集，且相关性分析显示A. veronii与OXA-12两者之间显著的正相关（图4b），因而其富集可能是由于其对于β-内酰胺类药物存在耐药性而在抗生素残留环境中获得生存优势。最显著的富集过程出现在二沉池到出水过程，而污泥中A. veronii含量非常低，证明水处理过程中的泥水分离过程可能也对A. veronii的富集有奉献（图4b）。A. veronii是典型的水生细菌，其嗜水性可能导致其在泥水分离过程中高度富集于出水。由于进水样本缺乏宏基因数据，论文又使用16S rRNA测序手段证实A. veronii是从进水到出水不断的产生富集（图4b）。为保证富集现象不是由于“相对丰度”引入的偏差导致，进行了qPCR特异性扩增A. veronii，结果进一步证实处理过程富集A. veronii这一结论的可靠性（图4c）。最后，利用A. veronii筛选培养基及A. veronii对β-内酰胺的耐药性分离获得了一株A. veronii单菌。其在血平板上的溶菌环和在电镜照片中明显的鞭毛结构均暗示该菌具有潜在致病性（图4d），需要进一步的动物实验以验证其致病性。

图4 | AM-WWTP富集A. veronii

（a）携带ARG的宏基因组草图所构建的系统发育树；（b）OXA-12与A. veronii具有密切联系；（c）qPCR结果证实A. veronii的富集；（d）A. veronii在不同培养基及电镜中的形态。

获得的Aeromonas veronii与临床分离株高度相似

将获得的AM-WWTP来源的A. veronii宏基因组草图与NCBI获得的所有A. veronii完整基因组进行比较发现，来自相同环境或地理位置的A. veronii具有更近的系统发育距离（图5a）。而与我们恢复的A. veronii具有最近同源关系的菌株分离自和污水处理厂处于同一地理区划的一位腹泻病人，进一步说明了污水处理厂出水中A. veronii存在的健康风险（图5b），需要进一步的流行病学调查以验证A. veronii传播的方向性。

图5 | 全球A. veronii系统发育分析

（a）根据环境来源或地理位置标注的A. veronii系统发育树；（b）包含A. veronii系统发育树分支。

最后，论文比较了该污水处理厂与其他水环境（包括非β-内酰胺制药污水处理厂）中A. veronii丰度，结果表明该污水处理厂存在对A. veronii的特异富集（图6），其丰度远高于其他水环境，该富集A. veronii现象也并未出现在其他非β-内酰胺制药污水处理厂。这可能是β-内酰胺药物残留特异性筛选天然β-内酰胺耐药的A. veronii，从进水到出水更长的筛选时间以及最后阶段的泥水分离过程是A. veronii在出水丰度最高的主要原因。

图6 | 该AM-WWTP对A. veronii的独特富集作用

（a）全球水环境样本来源示意图；（b）不同样本中A. veronii相对丰度。

总的来说，该研究表明AM-WWTP虽然能有效去除化学污染物，但却促进了抗生素抗性A. veronii从进水到出水的富集。A. veronii是一种对β-内酰胺具有内在抗性的人畜共患病原体，对人类、鱼类和其他水生动物构成巨大健康风险。在人类中，它可引起菌血症、腹泻、肠胃炎、腹膜炎、败血症、伤口感染和尿路感染。在鱼类中，它与腹胀、鳍裂、突出眼、出血性败血症和溃疡有关，经常导致疾病爆发和水产养殖中的重大经济损失。本研究发现也凸显了传统污水排放监测和风险评估的不足之处，这些监测和风险评估仅关注AM-WWTP废水中的化学品指标，忽视生物性污染物。未来应将污水ARG和ARB的监测纳入废水管理框架，以更好地保护人类和动物健康免受耐抗生素病原体的侵害。

参考文献

Xingshuo Wang, Meilun Wang, Wei Zhang, Hui Li, James M Tiedje, Jizhong Zhou, Edward Topp, Yi Luo & Zeyou Chen*. (2025). Treatment of antibiotic-manufacturing wastewater enriches for Aeromonas veronii, a zoonotic antibiotic-resistant emerging pathogen. The ISME Journal, doi: 10.1093/ismejo/wraf077

作者简介

王星烁（第一作者）

王星烁，南开大学博士研究生，主要从事微生物耐药性研究。

陈则友 （通讯作者）

陈则友，南开大学百名青年学科带头人，环境科学与工程学院教授、博士生导师。主要从事抗生素、病原微生物和抗性基因的污染监测、环境行为和风险研究。主持国家及省部级项目7项，包括国家自然科学基金面上项目2项、青年项目1项、国家重点研发青年科学家项目课题1项、国家重点研发子课题1项、天津市自然科学基金面上项目1项、江苏省自然科学基金青年基金项目1项；在国内外主流期刊发表论文50余篇，其中第一/通讯30余篇（含1篇ISME Journal、4篇Environmental Science & Technology、4篇Water Research、1篇Environmental Microbiology和1篇Applied and Environmental Microbiology）；申请发明专利3项；获南开大学青年教师教学竞赛奖；获江苏省农学会技术创新奖一等奖（排名4/9）；受邀担任国际SCI期刊Bull. Environ. Contam. Toxicol.，J. Hazard. Mater. Adv.青年编委、Front. Microbiol.专刊客座编辑等。

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