摘要：研究表明，抗生素耐药基因（ARGs）在城市污水处理厂（MWTP）中表现出季节性变化，但它们与细菌系统发育结构的关系尚不清楚。我们探索北京一个全尺寸MWTP中ARGs与活性污泥细菌群落之间的关系，发现季节性动态显著。北京冬季和春季ARGs丰度较高，临床相关高危A

作者：Shashika Kumudumali Guruge, Ziming Han, Shiting DaiBo等

期刊：Water Research

时间：2024.10.09

影响因子：11.4

DOI：10.1016/j.watres.2024.122598

摘要

研究表明，抗生素耐药基因（ARGs）在城市污水处理厂（MWTP）中表现出季节性变化，但它们与细菌系统发育结构的关系尚不清楚。我们探索北京一个全尺寸MWTP中ARGs与活性污泥细菌群落之间的关系，发现季节性动态显著。北京冬季和春季ARGs丰度较高，临床相关高危ARGs发生率最高。在ARGs的多样性和整体细菌群落中也观察到季节性的变化。利用基于机器学习的随机森林分类模型来识别ARGs和细菌属的生物标志物，作为季节差异的指标。随后使用随机森林回归模型分析了ARGs和细菌生物标记物之间的关系。结果表明，冬季和春季分枝杆菌、梭状芽胞杆菌和假单胞菌等潜在致病菌的富集程度较高，这是寒冷季节高风险ARGs富集的重要原因。相反，与活性污泥相关的功能分类群，如陶厄氏菌，表现出季节性波动和对ARGs的偏好，具有较小的临床意义。宏基因组分析进一步说明了分枝杆菌在寒冷季节对ARGs富集的贡献。我们的研究结果强调了活性污泥中人类来源的临床相关分类群和功能性细菌分类群对MWTP中ARGs季节性动态的集体影响。此外，本研究为MWTP多余污泥的安全处理提供了有价值的见解。

方法与内容

本研究采集北京市某大型市政污水处理厂（MWTP）的活性污泥样本，按季节分组，记录水温、溶解氧、pH等环境参数。使用FastDNA SPIN Kit提取DNA，通过Illumina HiSeq平台进行16S rRNA基因V4-V5区扩增子测序，另外宏基因组测序使用Illumina X-ten平台，利用MEGAHIT组装、metaWRAP分箱和CARD数据库注释ARGs，进行Bray-Curtis距离主坐标分析，香农指数评估α多样性，建立随机森林分类模型筛选季节性生物标志物（ARGs和菌属），回归模型分析菌属对ARGs丰度的影响。

结果

1.ARGs的季节性变化

在检测的MWTP样本中共检测到19种ARGs类型和419种ARGs亚型，冬季ARGs总丰度最高，为0.408 copies/cell，春季次之（图1A）。另外冬季磺胺类和四环素类ARGs显著富集（P

本研究系统地检查了世卫组织列出的37种高风险ARGs，12种被检出（图1C），其中,氨基糖苷抗性基因aac(6’)-I的丰度全年都很高，春季观察到的平均相对丰度最高,冬季ermB和tetM显著升高。研究结果表明，MWTP污泥期新型四环素耐药基因tet(X)变异频率较高，变异体在寒冷季节大量存在。

本研究以100%的检测频率确定季节性核心ARGs，绘制韦恩图确定全年的核心ARGs有82个，主要由多重耐药、β-内酰胺类和氨基糖苷类组成（图2A）。随机森林模型筛选出15种ARGs作为季节性生物标志物（图2B），如冬季的磺胺类耐药和大环内酯类耐药，夏季的多重耐药。

图1. 某城市污水处理厂抗生素耐药基因（ARGs）的季节性变化

图2. 城市污水处理厂一年内核心ARGs和季节性动态生物标志物ARGs

2. MWTP中的抗生素

我们分析了夏季和冬季进水中磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类和大环内酯类四种抗生素类别及其亚类的浓度，发现冬季进水中的磺胺类药物和大环内酯类药物浓度显著高于夏季，结合冬季由于寒冷温度下的免疫力低下导致人群抗生素消耗的增加，这突出了影响人类健康和抗生素耐药性在环境中传播的季节性动态。另外，在网络分析已观察到大环内酯类药物与四环素亚类药物之间存在显著相关性，在相关分析中表明抗生素与高发ARGs类型密切相关，这表明活性污泥中抗生素残留的选择压力对ARGs的流行起着重要的促进作用。

3.细菌群落的季节性变化

由图3A可知，全年在门水平上占主导地位的优势菌门有变形菌门（24.1%）、拟杆菌门（14.25%）、放线菌门（14.20%）、厚壁菌门（13.19%）和绿弯菌门（11.56%），且大多数顶级门对秋季表现出明显的偏好。由Alpha多样性指标显示，丰富度和多样性在秋季较高，冬季物种组成异质性较高（图3B）。23个潜在病原菌属中，17个被检出，相对丰度谱如图3C所示，冬季病原菌属丰度最高，为4.81%，分枝杆菌和梭菌全年存在，冬季丰度达峰值。

图3.城市污水处理厂细菌群落的季节变化

图4. 城市污水处理厂全年内的核心属和显示季节动态的生物标志物属

以100%频率筛选属获得核心菌，全年和季节性核心细菌属在图中表示（图4A），全年核心菌属172个，优势菌包括变形菌门（9.32%）、放线菌门（8.08%）和厚壁菌门（7.37%）。与ARGs生物标志物选择类似，随机森林统计方法筛选出8个季节性生物标志菌属（图4B）。

4.活性污泥功能分类群和临床相关分类群对ARGs季节性动态的贡献

在随机森林回归模型中，将生物标记ARGs和具有生物标记属和潜在病原体的高风险ARGs作为输入进行分析，结果显示，临床相关分类群和活性污泥功能分类群对ARGs的影响存在显著差异（图5A），临床相关分类群与高危ARGs密切相关。8个生物标志物潜在致病性分类群和活性污泥功能分类群的不同季节模式被分别可视化（图5B），这3种潜在病原菌和2个活性污泥功能分类群（Romboutsia和Ornithinibacter）均在冷季富集，3个活性污泥功能分类群（Thauera、IMCC26207和Longivirga）在暖季富集。

图5. MWTP中ARGs季节性动态与细菌属季节性动态的关系

宏基因组分箱进一步验证活性污泥功能类群和临床相关类群动态与ARGs动态之间的关系。获得的5个高质量bin中有3个bin的注释标注到了属水平（图6A、B）。分枝杆菌（bin.100和bin.11）在春季及冬季的丰度高于其他季节，同时携带多种ARGs；陶厄氏菌（bin.76）在秋季丰度高于其他季节，且未检出ARGs（图6B、C）。

图6. 通过宏基因组binning方法获得携带ARGs的基因组框架图

结论

该研究优先考虑并更深入地研究了MWTP中细菌群落与ARGs动态之间的相互作用。这项研究的重点是高风险ARGs和与人类临床环境密切相关的潜在病原体。我们的研究结果显示了它们的普遍性，特别是它们在寒冷季节的丰度更高。利用随机森林机器学习方法和宏基因组分类，我们重点介绍了污泥细菌群落中在驱动ARGs动态中表现出不同作用的功能和临床相关分类群。特别是，在较冷的月份，发现高风险ARGs与潜在致病分类群之间存在强烈关联，而活性污泥功能分类群的波动与ARGs的动态密切相关，而临床后果较小。总之，本研究通过对细菌系统发育结构的解开，提高了我们对MWTP中ARGs季节性动态的理解。我们的研究结果可用于评估污泥的生物安全性，从而推进基于废水的流行病学领域。寒冷季节传染病的高易感性导致人体病原体的高释放，故MWTP可以成为某一地区流行病监测和抗生素使用监测的目标。

来源：科学时代步