摘要：遗传变异对育种计划和突变体筛选至关重要，但传统诱变方法受限于基因冗余和靶向特异性不足。CRISPR-Cas9虽能实现精准基因编辑，但在作物改良中的规模化应用仍面临挑战。本研究在番茄中构建了全基因组多靶向CRISPR文库，通过设计15,804个独特单导RNA（s
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遗传变异对育种计划和突变体筛选至关重要，但传统诱变方法受限于基因冗余和靶向特异性不足。CRISPR-Cas9虽能实现精准基因编辑，但在作物改良中的规模化应用仍面临挑战。本研究在番茄中构建了全基因组多靶向CRISPR文库，通过设计15,804个独特单导RNA（sgRNA），每个靶向同一基因家族的多个基因，解决了冗余问题并提升了编辑规模。通过生成约1300个独立CRISPR株系，成功鉴定了与果实发育、风味、营养吸收及病原响应相关的突变体。此外，开发的CRISPR-GuideMap双条形码标记系统实现了大规模sgRNA追踪。结果表明，多靶向CRISPR文库具有高效性和扩展性，为植物基础研究与作物育种提供了新策略。
研究目的：解决传统诱变方法在靶向性、冗余性和遗传连锁上的局限性，开发规模化多靶向CRISPR文库以克服番茄基因组功能冗余。
研究方法：
基于基因家族系统发育树设计sgRNA，允许单个sgRNA靶向多个同源基因。
构建10个功能分组的子文库，覆盖转运蛋白、转录因子、酶等基因家族。
开发CRISPR-GuideMap双条形码系统，通过高通量测序追踪sgRNA。
研究对象：番茄（Solanum lycopersicum）M82和Alisa Craig品种。
文库设计：设计15,804个sgRNA，靶向番茄34,075个基因中的10,036个，平均每个sgRNA靶向2.23个基因。
编辑效率：通过CFD评分和错配数预测Cas9切割效率，发现低错配（0-1）和高CFD评分（>0.8）显著提高编辑成功率。
表型筛选：
鉴定出与病原易感性（NPF1家族突变）、低磷响应（PT2/PT6突变）相关的突变体。
发现调控果实大小（DOF、AP2家族突变）和糖分含量（ERF、bZIP家族突变）的基因。
追踪系统：CRISPR-GuideMap成功追踪236株植物中的146个sgRNA，匹配率超95%。
多靶向CRISPR文库通过同时编辑同源基因，有效克服功能冗余，揭示隐性表型。
CRISPR-GuideMap系统实现了全库sgRNA的高效追踪，提升了基因型-表型关联分析的可靠性。
该策略可扩展至其他作物，为功能基因组学和精准育种提供了高效工具。
首个番茄全基因组多靶向CRISPR文库：首次在作物中系统整合基因家族靶向设计，突破单基因编辑限制。
CRISPR-GuideMap技术：双条形码标记结合高通量测序，实现全库sgRNA追踪，避免表型依赖性筛选。
错配容忍设计：通过优化sgRNA与靶基因的错配容忍度，平衡编辑效率与多靶向能力。
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来源：薛定谔的科学杂谈