摘要：在真核细胞内实现精准可控的非天然催化反应，一直是合成生物学与化学生物学领域的重大挑战。传统的人工金属酶（ArM）技术虽具潜力，但面临酶提纯困难、递送效率低、稳定性差等瓶颈。湖南大学白玉罡教授团队中吴彤博士等研究者独辟蹊径，从自然界的内共生机制获得灵感，开发出全

在真核细胞内实现精准可控的非天然催化反应，一直是合成生物学与化学生物学领域的重大挑战。传统的人工金属酶（ArM）技术虽具潜力，但面临酶提纯困难、递送效率低、稳定性差等瓶颈。湖南大学白玉罡教授团队中吴彤博士等研究者独辟蹊径，从自然界的内共生机制获得灵感，开发出全新的"人工亚细胞器"技术，相关成果发表于《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc.）。

大自然策略的工程化再现：从内共生到人工细胞器

在上古时代，原始真核细胞通过吞噬蓝细菌演化出叶绿体，这一经典的内共生理论启发了研究团队。他们设想：若将携带催化功能的工程菌改造为"人工细胞器"，能否在真核细胞内实现稳定的非天然催化？如果可以，那么真核细胞内的人工金属酶应用就不再需要对真核细胞做基因工程改造，只需要在非常成熟的原核细胞如大肠杆菌平台上做工程化改造，再将其引入到真核细胞中即可。

基于此考虑，研究团队基于前期开发的"位于人工庇护系统中的人工金属酶：液-液相分离策略"（ArMAS-LLPS）技术，首先在大肠杆菌内构建了特殊的催化微环境。通过构建带有无规序列（IDR）的HaloTag-SNAPTag融合蛋白（同时也是人工金属酶的骨架，即Artificial apoenzyme），并诱导其进行胞内液-液相分离，成功在菌体内形成了液滴状催化区室。由于该催化区室中的蛋白质正是用于构建人工金属酶的蛋白骨架，这时再在系统中引入铜、钯、钌等金属辅基便可在区室中原位构建出人工金属酶。由于催化腔室可以很好地保护人工金属酶，这种工程菌本身即成为高效的"全细胞催化剂"，但如何让细菌安全进入真核细胞成为下一个关键突破点。

图1. 内共生过程和本文中所设计的人工细胞器建立策略的卡通示意图。

基于星形聚合物的菌膜改造：从灭菌到跨膜递送

该团队设计合成了36种星形阳离子聚合物，最终筛选出最佳分子P26（图2）。这种聚合物能高效地锚定在细菌膜表面，通过电荷反转使细菌获得穿越真核细胞膜的能力，同时彻底灭活工程菌但保持菌体结构的完整性，确保菌体内部的人工金属酶体系仍然正常工作（图3a/b）。透射电镜观察显示，P26修饰后的工程菌仍保持完整的催化区室结构，其内部金属成分在催化区室中的聚集清晰可见（图3c）。团队证实了在巨噬细胞、乳腺癌细胞等模型中，P26修饰的工程菌展现出卓越的进胞能力（图3f），但进胞的机制基于细胞系的不同而有所不同，并且其最终在细胞内的定位也有所不同。同时，P26的修饰会导致膜通透性的提升，从而促进了底物与产物在膜内外的运动，这使得P26修饰的工程细菌的催化效率（基于TOF）相较未修饰的细菌有明显的（图3d/e）。

图2. (a) 星形阳离子聚合物的合成路线示意图。(b) 共聚焦显微镜图像显示 HS-E. coli 与36个荧光标记的星形阳离子聚合物孵育后的细菌结合情况。(c) 36个星形聚合物的单体组成、比例及其与 HS-E. coli 相互作用的关键指标：膜附着率（MA%）和杀菌率（BKR%）。

图3. (a) HS-E. coli 全细胞催化系统的构建示意图：通过聚合物修饰实现内部区室化功能，增强人工金属酶（ArM）的催化效率。(b) HS-E. coli 与不同浓度 P26 孵育后的表面ζ电位变化（反映细菌膜电荷修饰程度）。(c) TEM-EDS分析显示，经过聚合物修饰的HS-E. coli@P26成功在其液-液相分离（LLPS）区室内组装了铜和钯基人工金属酶。能谱面扫结果清晰地显示，Cu和Pd元素信号在LLPS微滴区域内呈现显著富集。(d) HS-E. coli@P26 的共聚焦显微镜图像：绿色荧光标记膜结合 P26，蓝色荧光显示 CuAAC 催化产物。(e) CuAAC反应动力学分析。(f) HS-E. coli@P26 的细胞摄取能力分析：共聚焦显微镜图像显示，HS-E. coli@P26（绿色）可有效内化至 RAW 264.7（巨噬细胞）和 MCF-7（乳腺癌细胞）中，而未经修饰的 HS-E. coli 则未观察到显著摄取。

基于人工催化细胞器的治疗途径：从病原体清除到肿瘤协同杀伤

（1）精准清除胞内耐药金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是一种典型的胞内病原体，它可以隐藏于巨噬细胞内而不被巨噬细胞杀灭，甚至可以繁衍后代。基于此，研究团队构建了巨噬细胞-金黄色葡萄球菌感染模型（图4a）。由于在这种情况下金黄色葡萄球菌实际上是被巨噬细胞所“保护”的，传统抗生素环丙沙星在256 μg/mL的高浓度下仅能降低4个数量级的病原菌。环丙沙星的低效性主要是因为其本质上是个两性离子，难以跨膜进胞。研究团队对环丙沙星的结构进行了改造，令其变为疏水性更强的负电荷前药结构Proc-Cipro，方便其进入巨噬细胞并被P26工程菌转化为原始的环丙沙星（图4c）。通过将P26工程菌引入至被感染的巨噬细胞内（图4b），并使用前药Proc-Cipro，团队观察到了基于工程菌的胞内人工细胞器能够原位激活Proc-Cipro，使得该化合物在128 μg/mL剂量即可实现完全灭菌（图4d）。

图4. (a) Pd-HS-E. coli@P26 的作用机制示意图：聚合物修饰的全细胞催化剂进入宿主细胞后，激活前药 Proc-Cipro 释放活性抗生素（环丙沙星），发挥胞内抗菌作用。(b) 共聚焦显微镜图像显示 金黄色葡萄球菌（蓝色）感染的 RAW 264.7 巨噬细胞及其内化的 Pd-HS-E. coli@P26（绿色）。(c) 细胞通透性比较：环丙沙星 与其前药 Proc-Cipro 的摄取效率定量分析（Proc-Cipro 表现出显著增强的细胞穿透能力）。(d) Pd-HS-E. coli@P26 的抗菌效能验证：在感染模型中，该催化剂可有效激活 Proc-Cipro，显著清除 RAW 264.7 细胞内的 金黄色葡萄球菌。

（2）肿瘤内的并行催化与原位联合用药

由于ArMAS-LLPS策略允许催化系统的模块化构建，因此该团队创新性地将铜、钯人工金属酶同时集成于同一工程菌，并将其引入到真核细胞中，形成了可同时催化点击化学反应和炔丙基脱除反应的人工亚细胞器。在细胞内，该人工细胞器可以同时合成TA-RSV（白藜芦醇衍生物，基于点击化学反应）并激活前药Pro-5FU（形成5-氟尿嘧啶，基于炔丙基脱除反应）（图5a） 。由于前药相对于活性药物分子来说其进胞能力更强，在高效非天然催化的帮助下，前药组合的效果比直接使用药物的效果更好（图5b）。Western blot证实这种原位激活、合成药物的策略并不会改变药物本身的机制，该药物组合仍然通过协同抑制Akt/STAT3通路显著增强凋亡效应（图5c/d）。在荷瘤小鼠模型中，团队进一步证明了该原位激活策略的优势——由于前药仅在病灶处激活，该策略对模型动物的毒性大幅降低，动物在接受药物治疗后未出现明显体重下降等副作用（图6a/b），并且器官切片分析显示该策略也极大地降低了治疗过程所产生的器官毒性（图6c）。同时，这种基于人工亚细胞器的原位激活联合用药仍能够对癌细胞造成高效杀伤作用，这使得其前药策略的治疗指数相较直接使用药物要高得多。因此，这种"人工亚细胞器构建+原位催化"策略是一种降低化疗的脱靶毒性问题的有潜力的解决方案。

图5. (a) 作用机制示意图：聚合物修饰的双金属全细胞催化剂 Cu&Pd-HS-E. coli@P26 通过内化进入肿瘤细胞，实现前药激活与药物合成子的原位组装，显著增强抗癌疗效。(b) 抗癌效能评估：在 MCF-7细胞内，Cu&Pd-HS-E. coli@P26 介导的细胞内药物生成显著提升肿瘤杀伤效果。(c) CD44水平验证：Western blot分析显示，经 Cu&Pd-HS-E. coli@P26 激活的前药处理组中，肿瘤干细胞标志物 CD44 表达水平最低，表明其可有效抑制肿瘤干细胞特性。(d) 基因水平验证：qRT-PCR分析证实，Cu&Pd-HS-E. coli@P26 激活的前药处理可显著上调促凋亡基因 Bax 的表达，揭示其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制。

图6. (a) 基于 Cu&Pd-HS-E. coli@P26 的人工细胞器系统体内治疗策略示意图。(b) 小鼠体重变化曲线。(c) 肾脏组织H&E染色显示直接给药组观察到明显的肾小管损伤。

总结

本文立足于ArMAS-LLPS技术，本研究实现了三点创新：（1）内共生仿生设计：将工程菌转化为稳定的人工亚细胞器，使得在不使用真核系统基因工程的情况下也可以在真核细胞内实现人工金属酶的催化；（2）跨膜递送革新：星形聚合物实现工程细菌的安全递送与功能增强；（3）模块化催化平台：该胞内催化体系可根据需求灵活搭载不同人工金属酶催化剂。此项研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、湖南省自然科学基金等项目支持。

Creation of Artificial Subcellular Organelles Using Compartmentalized Escherichia coli Bodies for Artificial Metalloenzyme-Mediated Abiotic Catalysis in Eukaryotic Cells

Tong Wu, Yating Fei, Yingjiao Deng, Xianhui Chen, Yuli Duan, Ying Liu, Yugang Bai*

J. Am. Chem. Soc., 2025, DOI: 10.1021/jacs.5c00473

本团队目前招收博士后、科研助理、26年入学的博士以继续扩展课题组在人工金属酶、活体内非天然催化方面的研究，有意者请联系课题组PI。

来源：X一MOL资讯