摘要：我们的肠道每天都暴露在大量外来抗原面前，包括食物以及共生微生物。这些抗原本具有诱发免疫反应的潜力，但健康人体却能够“容忍”它们，避免过度炎症。这种免疫耐受的关键在于一类外周诱导的调节性 T 细胞（peripherally induced Treg，简称 pTr

我们的肠道每天都暴露在大量外来抗原面前，包括食物以及共生微生物。这些抗原本具有诱发免疫反应的潜力，但健康人体却能够“容忍”它们，避免过度炎症。这种免疫耐受的关键在于一类外周诱导的调节性 T 细胞（peripherally induced Treg，简称 pTreg），它们能够“压制”针对这些外来抗原的免疫反应，从而维持肠道免疫稳态。抗原呈递细胞（antigen-presenting cells, APC）（如树突状细胞 DC、B 细胞等）在免疫系统中扮演着指挥官的角色，决定 T 细胞是走向活化攻击，还是分化为耐受状态。长期以来，人们普遍认为 DC 具有高度可塑性：在不同环境中，它们既能诱导效应性 T 细胞，也能诱导 pTreg。直到 2022 年，三篇背靠背发表在Nature杂志上的研究（其中之一来自本论文作者团队）发现：共生微生物特异性pTreg 并非由经典型 DC（cDC）诱导产生，而是由表达RORγt 的特殊 APC驱动生成。这表明，外周免疫耐受并非源于DC 的功能状态切换，而是由一类专门分化出的“耐受诱导型 APC”所介导。然而，“耐受诱导型 APC”的确切身份至今仍无定论。已有研究提出多种候选群体，包括表达 MHCII 的 3 型天然淋巴样细胞（MHCII⁺ ILC3）以及多个非 ILC 的细胞类型，如 Janus cells、Thetis cells 和 RORγt-DC 等。其中非 ILC 群体之间可能存在交叠，甚至代表一个异质性混合的细胞集合。因此，厘清真正具备诱导 pTreg 分化能力的 APC 的确切身份，已成为当前外周免疫耐受研究的核心问题之一。另一方面，除了对共生微生物的耐受外，肠道免疫系统还必须与食物中的抗原达成和平共处。然而，介导食物抗原耐受、诱导相应 pTreg 分化的关键 APC 类型，同样尚未被明确界定。

近日，来自纽约大学医学院的Dan Littman教授团队（博士后付榴辉为第一作者，署名第一位）在Nature杂志上发表题为

此前研究发现，能够诱导微生物特异性 pTreg的APC 在发育过程中会表达 CD11c 以及转录因子 RORγt，但 RORγt 本身是否为这些细胞发挥耐受诱导作用所必需，尚未得到直接验证。为此，作者首先使用了 CD11c-cre 条件性 Rorc(t) 敲除小鼠（Rorc(t)ΔCD11c），并向已定殖肠道条件致病菌幽门螺杆菌（Helicobacter hepaticus，简称 Hh）的小鼠体内，过继输入了来源于 Hh 特异性 TCR 转基因小鼠的 naïve CD4⁺ T 细胞。两周后，在对照小鼠的大肠固有层和肠系膜淋巴结中，大部分过继输入的 T 细胞成功分化为共表达 FOXP3 和 RORγt 的 pTreg。而在 Rorc(t)ΔCD11c小鼠中，pTreg 分化几乎完全受阻，取而代之的是大量表达 T-bet 和 RORγt 的 Hh 特异性 Th17/Th1 炎性细胞，表明 pTreg 诱导型 APC 的耐受功能依赖于其自身的 RORγt 表达。

RORγt 是多个淋巴系细胞的关键转录因子，包括胸腺中的 CD4⁺CD8⁺ 双阳性细胞、Th17、Tγδ17 和 ILC3 等。由于同一个基因座中的不同顺式调控元件可能赋予其在特定细胞类型中的表达特异性——例如 Bcl11a 基因中控制红系细胞表达的增强子就是治疗镰刀型贫血的靶点。由此，作者提出假设：Rorc(t) 基因座中可能也存在具有细胞类型特异性的调控元件，能够选择性调控 RORγt 在不同 RORγt⁺ 细胞中的表达，包括诱导 pTreg 分化的APC。为验证这一猜想，作者对多种 RORγt+ 细胞类型进行了染色质开放性测序（ATAC-seq）分析，结果显示 Rorc(t) 区域在不同细胞中呈现出显著差异的染色质可及性。进一步构建的多个 Rorc(t) 顺式元件缺失小鼠模型揭示：+11 kb 在除体外分化的 Th17 外的所有 RORγt⁺ 细胞中均保持开放状态，是一段共享的调控元件；+3 kb 是 Th17 和 Tγδ17 细胞的关键增强子；+6 kb 为 Th17 细胞特异性所需；而 +7 kb 则主要影响 ILC3 和 Tγδ17细胞的数量。深入分析 Δ+7 kb 敲除小鼠时发现，尽管其 RORγt⁺ ILC3 数量下降，但 ILC3 介导的功能，包括维持肠道淋巴结构和抵御肠道致病菌柠檬酸杆菌感染的能力均未受到明显影响。然而，当将 Hh 特异性 CD4⁺ T 细胞过继输入 Δ+7 kb 小鼠后，pTreg 的分化严重受阻，转而出现大量Th17/Th1 炎性细胞。这表明，Rorc(t) +7 kb 元件虽然对经典 ILC3 功能并非必需，却对pTreg 诱导型 APC 的耐受功能至关重要。

上述结果显示，RORγt 和Rorc(t) +7 kb顺式调控元件对于 pTreg 诱导型 APC 的耐受功能是必不可少的，然而它们是否也参与该类细胞的发育，仍不清楚。于是作者分选了 Δ+7 kb 和 Rorc(t)ΔCD11c突变小鼠及相应对照小鼠的肠系膜淋巴结中表达 MHCII 的天然免疫细胞，并进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）分析。结果发现，有一群非 ILC 的 Rorc⁺ 细胞表达诱导 pTreg 分化所必需的关键基因，如 Ccr7 和 Itgb8 等。由于该细胞群特异性高表达Prdm16，作者称其为 Prdm16⁺ APC。有趣的是，在 Δ+7kb 小鼠中，Prdm16⁺ APC 相较对照组显著减少约 60%，尽管 Rorc⁺ ILC3 也有所下降；而在 Rorc(t)ΔCD11c小鼠中，Prdm16⁺ APC 群体则出现特异性完全缺失。这些结果表明，Prdm16⁺ APC 极有可能就是负责诱导共生微生物特异性 pTreg 的关键耐受型 APC 群体。为进一步解析 Prdm16⁺ APC 的分子特征，作者使用单细胞多组学联合测序（multiome scRNA-seq/scATAC-seq），发现该细胞群体在多个 DC 关键基因位点的染色质开放性模式与cDC高度一致，明显区别于 ILC3，提示其在谱系归属上更接近 cDC 而非 ILC。作者还建立了用于分析 PRDM16⁺ APC 的流式细胞术策略，结果显示该群体在表面标志物表达、细胞大小和颗粒度等方面亦更接近 cDC。利用这一策略，作者在 Rorc(t)ΔCD11c小鼠中证实了 PRDM16⁺ APC 的特异性缺失。紧接着，作者构建了 RORγt-cre 条件性 Prdm16 敲除小鼠（Prdm16ΔRORγt），结果显示该小鼠中 PRDM16⁺ APC 同样特异性缺失（ILC3不受影响），且过继输入的 Hh 特异性 pTreg 分化几乎完全受阻。这些结果共同表明，PRDM16⁺ APC 是一类不同于 ILC3、在谱系上更接近 cDC 的抗原呈递细胞，正是此前未被明确的 pTreg 诱导型 APC。因此，作者将这一关键群体命名为PRDM16+RORγt+ tolDC。

值得注意的是，即使在未定殖Hh的条件下，tolDC 缺陷小鼠（包括 Prdm16ΔRORγt、Rorc(t)ΔCD11c、 Δ+7 kb 和MHCIIΔRORγt）肠道固有层中的内源性 RORγt⁺ pTreg 也显著减少，伴随 Th2 细胞比例升高。年长的突变小鼠甚至还出现血清 IgE 升高等 II 型炎症特征，提示 tolDC 可能也参与了对食物抗原的免疫调控。为验证 tolDC 是否也负责诱导食物抗原特异性 pTreg 并建立口服耐受，作者向突变小鼠和对照组小鼠中过继输入了来源于卵清蛋白（OVA）特异性 TCR 转基因小鼠的 naïve CD4⁺ T 细胞，并通过灌胃或饮水给予 OVA 抗原模拟口服摄入。结果显示，对照组小鼠能够有效诱导 OVA 特异性 pTreg（包括FOXP3+RORγt- 和 FOXP3+RORγt+两种表型），而 tolDC 缺陷小鼠中 pTreg 分化几乎完全受阻，转而出现 Th2 和 Tfh 等效应性 T 细胞的异常扩增，表明食物抗原耐受的建立遭到破坏。在用于研究口服耐受的“先喂后致敏”哮喘模型中，对照组小鼠在预先灌胃 OVA 后可有效抵御随后诱导的气道炎症，表现为肺部炎症评分下降、嗜酸性粒细胞浸润减少、Th2 细胞减少，以及 OVA 特异性 IgE 和 IgG1 水平显著下降。相比之下，即使经过同样的预处理，tolDC 缺陷小鼠仍表现出与未灌胃组相似的过敏性炎症反应，耐受诱导彻底失败。在类似设计的“先喂后致敏”食物过敏模型中，预喂 OVA的tolDC 缺陷小鼠同样无法抵御后续的食物过敏反应，包括体温骤降、血清中 OVA 特异性 IgE 和 IgG1 水平升高。这些结果表明，tolDC 也负责诱导食物抗原特异性 pTreg的分化和口服耐受的建立，在调控对食物抗原的免疫应答、预防过敏反应中发挥着核心作用。

最后，为探究小鼠中发现的 tolDC 是否也存在于人体中，作者对一名健康供体的肠系膜淋巴结样本进行了单细胞RNA测序分析，并在其中鉴定出一群非 ILC3 的 RORC⁺ 细胞，特征性高表达 PRDM16，且共表达 CCR7、ZBTB46 和 CD40等，具备与小鼠 tolDC 高度一致的分子特征。进一步分析来自人类肠道固有层（包括回肠和结肠）及扁桃体的公共单细胞测序数据，作者也在其中鉴定出 PRDM16⁺RORC⁺ 的 tolDC 样细胞群，表明该细胞群具有进化上的保守性，为未来探索人类肠道免疫稳态及相关疾病的调控机制提供了重要线索。

综上，该研究从多个层面系统性阐明了 tolDC 的身份、功能及其调控机制，为深入理解外周免疫耐受机制带来了关键性突破。首先，该研究回答了自 2022 年以来该领域最核心的问题——究竟是哪一群抗原呈递细胞诱导共生微生物特异性pTreg的分化。作者通过表型和功能分析，明确鉴定出这一细胞群体并命名为 PRDM16+RORγt+ tolDC，而且在人体组织中也发现了高度相似的同源细胞。同时，该研究还建立了一套稳定可靠的 tolDC 流式分析策略，为未来的深入研究奠定了基础。其次，该研究发现 tolDC 不仅调控共生微生物耐受，也负责诱导食物抗原特异性 pTreg 的分化，是建立口服耐受不可或缺的细胞基础。最后，作者揭示 tolDC 的耐受诱导功能依赖于两个关键转录因子——PRDM16 和 RORγt，并且通过系统性解析 Rorc(t) 基因座的顺式调控元件，发现其中的 +7 kb 对 tolDC 的发育与功能至关重要。这项工作不仅填补了外周免疫耐受研究中的关键缺口，也为开发治疗过敏、自身免疫等相关疾病的靶向干预策略提供了全新思路。

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来源：科学巴扎黑