摘要：维生素 K2 是一类具有重要生理功能的脂溶性维生素，其中甲萘醌 MK-7 是最具代表性和应用价值的形式。MK-7 通过激活骨钙素促进骨骼钙化，并能减少血管壁钙沉积，从而在骨骼健康和心血管保护中发挥关键作用。随着人口老龄化和健康需求的增加，MK-7 的市场需求持
维生素 K2 是一类具有重要生理功能的脂溶性维生素，其中甲萘醌 MK-7 是最具代表性和应用价值的形式。MK-7 通过激活骨钙素促进骨骼钙化，并能减少血管壁钙沉积，从而在骨骼健康和心血管保护中发挥关键作用。随着人口老龄化和健康需求的增加，MK-7 的市场需求持续上升。尽管化学合成可以提供产品，但过程复杂且成本较高，而微生物发酵因其可持续性和规模化优势被认为是更可行的途径。然而，微生物细胞内复杂的代谢调控限制了产量提升，使 MK-7 的工业化生产仍面临瓶颈。
近日，江南大学刘龙教授团队在 ACS Synthetic Biology 发表了相关研究成果，题为“Enhanced Menaquinone Biosynthesis by Engineering 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexadiene-1-carboxylate Synthase MenD to Alleviate Feedback Inhibition in Bacillus subtilis”。他们针对枯草芽孢杆菌 MK-7 合成途径中存在的潜在反馈调控进行了系统分析，并首次证实了由中间代谢物 1,4-二羟基-2-萘甲酸（DHNA）对关键酶 MenD 的反馈抑制作用。
通过一系列实验，他们揭示了反馈抑制在微生物合成 MK-7 中的核心瓶颈，并基于结构引导的酶工程手段构建了抗抑制突变体，最终使发酵产量提高了 22.3%。这一成果为天然产物的高效生物制造提供了新的思路，也展示了突破代谢调控限制的普适策略。
图 | 研究策略概览，揭示 DHNA 对 MenD 的反馈抑制并进行酶工程改造，成功解除合成瓶颈
研究团队首先通过培养实验确认了反馈抑制现象。当在培养基中补充外源 DHNA 时，枯草芽孢杆菌的生长受到明显抑制，而同时补充 MK-7 则能够缓解这种抑制，说明 DHNA 在代谢途径中可能对关键酶形成负反馈调控。为了进一步验证分子层面的作用，他们利用荧光淬灭实验直接检测 DHNA 与 MenD 酶之间的结合，结果显示 DHNA 能够显著降低酶的荧光信号，并且在辅因子存在时结合更为紧密。这一结果证明 DHNA 确实能以别构方式与 MenD 结合，从而削弱其催化活性。由于 MenD 负责催化 MK-7 合成的限速步骤，其被抑制必然对整个合成通路产生连锁影响，这为长期以来产量偏低的现象提供了合理解释。
在明确了限制环节之后，研究人员转向了酶工程设计。他们借助结核杆菌 MenD 的晶体结构信息，利用分子模拟预测枯草芽孢杆菌 MenD 中可能的别构结合位点，最终锁定了 R96、W322 和 R323 三个残基。围绕这些位点，研究团队构建了突变体文库，并创新性地利用一种基于生长表型的高效筛选方法，在高浓度 DHNA 存在的条件下进行选择。由于只有抗反馈突变体能够维持生长，这一方法大幅提升了筛选效率并直接对应研究目标。经过多轮筛选，最终获得了双突变体 MenDW322I/R323F，它在后续的功能验证中表现出优异的性能。
在体外酶学实验中，该突变体的活性较野生型提高了 43%，显示出更高的催化效率。在抑制实验中，野生型酶在 1μM DHNA 条件下完全失活，而突变体仍能维持几乎全部的活性。在细胞水平的验证中，研究人员将该突变体整合进一株高产工程菌 3AYAT02-IF，结果其在摇瓶发酵中的 MK-7 产量由 152.5 mg/L 提升至 186.5 mg/L，增幅达 22.3%，同时菌体的生长状况并未受到不利影响。
图 | 突变体在 DHNA 存在下仍保持高活性，并显著提高了 MK-7 产量
在进一步的表型分析中，研究人员意外发现携带突变体的工程菌株表现出更强的生物膜形成能力。显微镜观察表明，突变株的生物膜结构更加复杂和稳固，这可能是解除代谢抑制后，细胞能量代谢和微环境改善的间接有益副作用，对提升工业化发酵的细胞密度和稳定性具有积极意义。
为解释突变体抗抑制的分子机制，研究团队利用分子动力学模拟对 DHNA 与酶结合的过程进行了分析。结果显示，双突变体与 DHNA 的结合能较野生型升高约 8.5 kcal/mol，氢键和盐桥数量明显减少，这使得 DHNA 与酶分子的结合不再稳定，更容易脱离结合位点，从而无法有效抑制酶的活性。模拟结果与实验观测高度一致，为理解反馈解除提供了坚实的理论支持。
综上所述，该研究完整描绘了从发现代谢瓶颈、解析分子机制到实现工程优化的全过程。通过结构引导的酶工程手段，研究人员不仅提升了目标产物的合成水平，更提出了一种可以广泛借鉴的方法论，即通过精准突变削弱中间代谢物与关键酶的反馈结合，从而释放代谢通路的潜力。这一策略有望应用于其他天然产物的生物制造，为细胞工厂的优化提供普适思路。随着该工程菌株进一步优化并进入工业化验证阶段，其在维生素 K2 的大规模生产中具有广阔应用前景，也为功能性分子的绿色制造提供了新范式。
参考链接：
1.Sun X, Li Y, Xing L, et al. Enhanced Menaquinone Biosynthesis by Engineering 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexadiene-1-carboxylate Synthase MenD to Alleviate Feedback Inhibition in Bacillus subtilis. ACS Synth Biol. Published online August 28, 2025. doi:10.1021/acssynbio.5c00419
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来源：生辉SciPhi
