四川大学李建树教授AM：仿生硅藻支架为感染性骨缺损治疗提供新策略

摘要：近年来，随着生活条件改善和人类寿命延长，由创伤、肿瘤、慢性炎症和感染引起的骨疾病日益普遍，成为全球致残的主要原因之一。临床治疗骨缺损时常面临植入部位感染的挑战，持续性炎症和细菌生物膜形成不仅阻碍骨再生，还可能导致植入失败，威胁患者健康。尽管抗生素负载植入物显示

近年来，随着生活条件改善和人类寿命延长，由创伤、肿瘤、慢性炎症和感染引起的骨疾病日益普遍，成为全球致残的主要原因之一。临床治疗骨缺损时常面临植入部位感染的挑战，持续性炎症和细菌生物膜形成不仅阻碍骨再生，还可能导致植入失败，威胁患者健康。尽管抗生素负载植入物显示出一定的抗菌潜力，但其存在耐药性风险、局部释放难以持续、高浓度下的细胞毒性以及无法彻底清除生物膜等问题，限制了其应用。因此，开发具有环境响应性抗菌性能、可控降解和成骨-成血管协同作用的智能骨修复材料成为当前的研究热点。

受硅藻高效光捕获和抗氧化机制的启发，四川大学李建树教授、丁春梅副教授、陈嵩教授合作开发了一种基于壳聚糖-羟基磷灰石的多功能骨修复支架CH/FeCu@SiO₂。该支架通过集成铜掺杂铁针铁矿（Fe(Cu)OOH）纳米颗粒和介孔SiO₂保护层，实现了光热性能稳定与抗菌-成骨功能的协同作用。在近红外光照射下，该系统可产生局部温和高温（约42°C），并释放Cu²⁺实现高效抗菌（>99%）。同时，Fe(Cu)OOH模拟酶抗氧化活性，清除活性氧（ROS），促进M2型巨噬细胞极化，营造有利于骨再生的免疫微环境。此外，温和热疗和离子释放还可上调TGF-β信号通路、抑制破骨细胞分化，从而促进血管化骨再生和缺损修复。相关论文以“Diatom-Inspired Scaffold for InFected Bone Defect Therapy: Achieving Stable Photothermal Properties and Coordinated Antibacterial-Osteogenic Functions”为题，发表在Advanced Materials上，论文第一作者为Li Xinyi。

示意图1. CH/FeCu@SiO₂的合成及其通过光热效应应用于骨修复的示意图受硅藻启发，SiO₂包覆在支架表面提供保护，内部的CH网络稳定结构并支撑具有能量转换能力的Fe(Cu)OOH纳米颗粒，共同调控骨修复过程。在光热条件下，Fe(Cu)OOH纳米颗粒释放的Cu²⁺和Fe³⁺，结合近红外光产生的温热微环境和SiO₂壳层，共同促进细菌清除、M2极化、血管和骨重建，最终推动骨再生。

研究人员首先通过冷冻干燥法制备了具有100 μm孔径的3D多孔壳聚糖-羟基磷灰石（CH）支架，模拟天然骨基质结构。利用壳聚糖分子中氨基和羟基的螯合能力，原位矿化合成了Fe(Cu)OOH“类叶绿体”纳米结构，并通过化学气相沉积包裹SiO₂保护层，形成功能梯度的CH/FeCu@SiO₂仿生复合支架。元素映射证实Fe、Cu、Si和C成功整合于体系中，Cu占金属元素的2.1%。FTIR和XRD分析进一步验证了FeOOH和羟基磷灰石的成功矿化以及SiO₂层的存在。XPS显示Fe²⁺和Cu⁺的存在，其电子相互作用可能为ROS清除提供催化位点。该支架具有60.6%的孔隙率和显著增强的压缩性能（抗压应力提高3.58倍，杨氏模量提高2.81倍），SiO₂层延缓了降解速率，并调控了Cu²⁺的缓释行为，14天累计释放量为4.42 μg/mL，低于细胞毒性阈值。在光热性能方面，SiO₂“硅壳”显著提升了Fe(Cu)OOH的光热转换效率，CH/FeCu@SiO₂在808 nm近红外光照射下最高温度达69.5°C，且循环稳定性高（效率衰减

图1. 支架的形貌与理化性质表征 a) CH支架的SEM图像和EDS元素映射。 b) CH/FeCu@SiO₂支架的SEM图像和EDS元素映射。比例尺：100 μm。 c) 支架的FTIR光谱。 d) 支架的XRD图谱。 e) 各样品的XPS全谱和f) Fe 2p峰分峰拟合。 g) CH和CH/FeCu@SiO₂支架的孔隙率（n=4）。 h) CH和CH/FeCu@SiO₂支架的抗压性能（n=3）。 i) 支架在含酶PBS中的降解曲线（n=3）。 j) CH/FeCu和CH/FeCu@SiO₂支架中Cu元素的累计释放曲线（n=3）。 k,l) 干燥支架在近红外激光照射下的红外热成像图及温度变化曲线。 m) 浸没在PBS中的支架在近红外激光照射下的温度变化。数据以均值±标准误表示。

在抗菌性能评估中，CH/FeCu@SiO₂联合近红外照射对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率超过90%，显著高于其他组。扫描电镜显示含铜支架引起细菌膜破裂和胞质泄漏，活/死染色进一步证实其抗菌效果。该组合策略还能有效破坏生物膜，使生物量减少88%，其机制包括光热破坏生物膜基质、铜离子促进膜渗透性和Fenton样反应诱导氧化应激。在干细胞保护方面，该支架能显著降低H₂O₂诱导的ROS水平（降低69.2%），减少DNA损伤和细胞凋亡，并维持干铺展、迁移和成骨分化能力。ALP染色显示其能恢复H₂O₂损伤的成骨表型。

图2. 不同支架在有无近红外照射下的体外抗菌活性 a) 金黄色葡萄球菌和b) 大肠杆菌与不同样品在有无近红外光照下的菌落情况。 c,d) 大肠杆菌和e,f) 金黄色葡萄球菌的活/死菌比率（n=3）。 g) 浮游菌和h) 生物膜顶视图和截面图的活/死染色荧光图像及对应SEM图像。 i) 金黄色葡萄球菌和j) 大肠杆菌生物膜的活/死菌比率（n=3）。 k) 金黄色葡萄球菌和l) 大肠杆菌生物膜的结晶紫染色定量分析（n=3）。 m) 仿生支架的抗菌机制示意图。数据以均值±标准误表示。

图3. 不同支架在有无近红外照射下对BMSCs的ROS清除与干细胞保护作用 a) DCFH-DA染色荧光图像和b) 相对荧光强度（n=6）。比例尺：100 μm。 c) DNA/RNA损伤染色荧光图像和d) 线性荧光强度。比例尺：40 μm。 e) γ-H2AX染色荧光图像和f) γ-H2AX焦点数量（n=15）。比例尺：10 μm。 g) Vinculin荧光图像。比例尺：50 μm。 h) TUNEL assay荧光图像。比例尺：50 μm。 i) Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测BMSCs凋亡。 j) 正常、早期凋亡、晚期凋亡和坏死阶段细胞比例。 k) 成骨诱导后BMSCs的ALP染色。 l) CH/FeCu@SiO₂和近红外对凋亡和成骨效应的影响示意图。数据以均值±标准误表示。

在免疫调节方面，CH/FeCu@SiO₂联合近红外能有效清除LPS诱导的ROS，促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，M2型比例提高1.64倍。qPCR和Western blot显示其下调M1相关基因（TNF-α、iNOS），上调M2相关基因（IL-4R、Arg-1）。在成骨和成血管活性方面，该支架显著增强ALP活性和钙结节形成，上调Col1A1、OPN、Runx2等成骨基因表达，并促进内皮细胞形成管状结构。RNA测序分析显示其上调“细胞迁移”、“成骨发育”相关基因，富集TGF-β、PI3K-Akt信号通路，抑制破骨分化和TNF通路。在大鼠感染性股骨缺损模型中，CH/FeCu@SiO₂联合近红外照射表现出优异的抗感染和成骨能力，8周后缺损几乎愈合，骨体积分数（BV/TV）提高1.3倍，且未见皮肤损伤。组织学分析显示其促进新骨形成、胶原沉积和血管生成，并调节免疫微环境向M2型巨噬细胞主导的修复状态转变。TRAP染色显示破骨细胞活性降低，主要器官未见明显毒性反应。

图4. 不同支架在有无近红外照射下的体外免疫调节与巨噬细胞活化 a) 荧光图像、b) 流式细胞术和c) DCFH-DA阳性RAW 264.7细胞百分比（n=6）。比例尺：50 μm。 d) RAW 264.7细胞中4-HNE荧光图像。比例尺：20 μm。 e) 4-HNE染色相对荧光强度（n=15）。 f) RAW 264.7细胞骨架染色图像。比例尺：20 μm。 g) RAW 264.7细胞中iNOS和CD206荧光图像。比例尺：20 μm。 h) iNOS和CD206染色相对荧光强度（n=6）。 i) RAW 264.7细胞中M2巨噬细胞流式分析。 j) M1标志物（TNF-α、iNOS）和M2标志物（IL-4R、Arg-1）基因表达的qRT-PCR分析。 k) M1标志物（iNOS、CD86）和M2标志物（CD163、CD206）基因表达的Western blot分析。 l) LPS刺激下CH/FeCu@SiO₂+近红外对免疫调节和巨噬细胞活化的影响示意图。数据以均值±标准误表示。

图5. 不同支架在有无近红外照射下的体外成骨与成血管活性 a) 处理14天后BMSCs的ALP染色整体视图和显微图像。比例尺：400 μm。 b) ALP染色定量分析（n=6）。 c) 处理21天后BMSCs的ARS染色整体视图和显微图像。比例尺：400 μm。 d) ARS染色定量分析（n=6）。 e) 处理7天后BMSCs中Col1A1荧光图像。比例尺：20 μm。 f) Col1A1染色相对荧光强度（n=15）。 g) 处理12小时后HUVECs内皮网络形成荧光图像。比例尺：100 μm。 h) HUVECs内皮网络分支点定量分析（n=15）。 i) CH/FeCu@SiO₂+NIR组与CH组相比成骨基因上/下调的火山图（|log2FC|>1, p

图6. 不同支架在有无近红外照射下对感染性股骨缺损的体内骨再生 a) SD大鼠感染性股骨缺损中支架应用的手术步骤。 b) 不同激光功率密度下（808 nm, 1.0, 2.0, 3.0 W/cm²）大鼠股骨缺损处支架的温度变化。 c) 照射区域最高温度红外热成像图。 d) 植入物随时间温度曲线（808 nm, 2.0 W/cm²）。 e) 植入2、4、8周后股骨组织照片。 f) 术后4、8周骨隧道微CT三维重建图像的前视图和横视图（缺损区域红色标出）。比例尺：4 mm。 g) BV/TV、h) Tb.N、i) Tb.Th、j) Tb.Sp在缺损部位的定量分析。 k) 体内抗感染评估及处理4天后细菌定植代表性照片。 l) CH/FeCu@SiO₂和近红外用于细菌清除、ROS清除和促进骨形成的示意图。数据以均值±标准误表示。

图7. 不同支架在有无近红外照射下体内骨形成的组织学评价 a) 植入4、8周后移植部位Masson三色染色。F：纤维组织；NB：新骨组织。比例尺：1 mm。 b) 术后8周OCN荧光图像。比例尺：150 μm。 c) 术后8周Col1A1荧光图像。比例尺：150 μm。 d) 术后8周CD31荧光图像。比例尺：100 μm。 e) 术后8周CD163荧光图像。比例尺：50 μm。 f) 术后8周OCN染色相对荧光强度定量分析（n=8）。 g) 术后8周Col1A1染色相对荧光强度定量分析（n=8）。 h) 术后8周CD31染色面积定量分析（n=8）。 i) 术后8周CD163阳性细胞（M2巨噬细胞）百分比定量分析（n=8）。数据以均值±标准误表示。

综上所述，该研究通过仿生硅藻结构设计了一种具有稳定光热性能、协同抗菌-成骨功能的多孔支架，为感染性骨缺损的治疗提供了一种高效、安全的策略，并展现出良好的临床转化潜力。