摘要：免疫原性是指能被T、B细胞表面特异性抗原受体（TCR或BCR）识别及结合，引起免疫应答的性能，即能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生致敏淋巴细胞和免疫效应物质抗体的特性。大分子类型药物（如抗体类、融合蛋白、重组蛋白、基因治疗产品、疫苗等）
免疫原性是指能被T、B细胞表面特异性抗原受体（TCR或BCR）识别及结合，引起免疫应答的性能，即能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生致敏淋巴细胞和免疫效应物质抗体的特性。大分子类型药物（如抗体类、融合蛋白、重组蛋白、基因治疗产品、疫苗等）以及细胞治疗产品（如CAR-T细胞疗法）等都可能具有免疫原性，其进人体后，人体可能会产生抗药抗体（Anti-drug antibody，ADA），进而可能影响药物的药代动力学、药效动力学、安全性和有效性，所以免疫原性一直是大分子药物在临床试验期间的重要关注点。
对于抗药抗体的检测，FDA、NMPA、EMA三者都建议使用多层级的评估策略[1, 2, 3]：首先对所有样品进行筛选试验，筛选出疑似阳性样品，之后对疑似抗体阳性样品的特异性进行确证试验，以确定阳性样品，最后对已确证抗体阳性的样品进行例如滴度试验、抗体中和活性、抗体同种型、亚型或结合表位检测等。筛选和确证试验分别通过与筛选阈值（Screening cut point）和确证阈值(Confirmatory cut point)的比较来进行结果的阴阳性判定。在临床试验前的方法学验证阶段（Pre-study validation）受试人群的样品一般难以获得，这些阈值通常是使用健康人群个体基质样品建立的。为确保真实样品的检出率，通常基于5%的假阳性率，通过数据的统计分析来确定筛选阈值。
在临床样品分析的时候，来自于疾病人群的样品在ADA检测中可能具有不同的背景值。这会导致在方法验证期间所确定的阈值不一定适用于临床样品的检测分析，所以在临床样品分析阶段，首先要确认之前的阈值是否适用于临床真实样品。虽然这在FDA于2019年发布的免疫原性检测指导原则中也有提及[2]，但是其未明确规定如何对阈值的适用性进行确认。有些发表的文献说可以通过临床试验基线样本（Baseline/Pre-dose sample）的假阳性率是否在2-11%的范围内来判断阈值是否有适用性[4, 5, 6]，但是这一判定标准来源于一份几乎没有细节的会议报告[6]，所以难免使人对其可靠性有所疑虑。Tan等[7]人利用二项分布和假设检验原理通过计算临床试验基线样本的假阳性样本数或假阳性率的范围来判定阈值适用性的思想和方法很值得借鉴。
假设在临床试验前的方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测，则每个临床试验基线样本被筛选检测为阳性的概率为0.05，被筛选检测为阴性的概率为0.95。这就转变为基于二项分布的假设检验问题了。例如，取显著水平为0.05，如果原假设为真，对100个基线样本进行检测，则：
出现至少10个假阳性样本（即出现至多90个阴性样本）的概率p为0.0282(用EXCEL中的BINOM.DIST函数计算，BINOM.DIST(90,100,0.95,1)=0.0282)。因p
出现至少9个假阳性样本（即出现至多91个阴性样本）的概率p为0.0631 (BINOM.DIST(91,100,0.95,1)=0.0631)，因p>0.05，故接受原假设，即在临床试验前的方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测。
出现至多1个假阳性样本（即出现至少99个阴性样本）的概率p为0.0371 (BINOM.DIST(1,100,0.05,1)=0.0371)。因p
出现至多2个假阳性样本（即出现至少98个阴性样本）的概率p为0.1183 (BINOM.DIST(2,100,0.05,1)=0.1183)，因p>0.05，故接受原假设，即在临床试验前的方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测。
所以，当基线样本数量为100时，出现的假阳性样本数在2-9，即假阳性率为2.0-9.0%，可以判定在临床试验前的方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测。
同理，可以计算出不同的基线样本数量时，能够接受阈值依然适用的假阳性样本数量或假阳性率的上下限，详见下表：
由上表数据可得，例如，基线样本量为180时，如果假阳性样本的数量在4-14范围内或假阳性率在2.2-7.8%范围内，则方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测。另外，如果方法学验证阶段以5%假阳性率建立的阈值适用于真实临床样本的检测，随着基线样本数量的增大，基线样本的假阳性率的上下限会逐渐向5%趋近，而不是固定不变的。
用同样的方法，结合基线样本数量，可以计算以其他假阳性率水平（比如1%）建立的阈值适用性的范围。
参考文献
[1] 国家药品监督管理局药品审评中心，《药物免疫原性研究技术指导原则》，2021年3月。
[2] Guidancefor Industry–Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products—Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. US Department of Health and Human Services, Food and DrugAdministration–Center for Drug Evaluation and Research, Centerfor Biologics Evaluation and Research. Center for Devices and Radiological Health. Jan 2019.
[3] Guideline on immunogenicity assessment of therapeutic proteins. European Medicines Agency. Rev 1 2017.
[4] Devanarayan V, Smith WC, Brunelle RL, Seger ME, Krug K, Bowsher RR. Recommendations for Systematic Statistical Computation of Immunogenicity Cut Points. AAPS J. 2017 Sep;19(5):1487-1498. doi: 10.1208/s12248-017-0107-3. Epub 2017 Jul 21. PMID: 28733862.
[5] Myler H, Pedras-Vasconcelos J, Phillips K, Hottenstein CS, Chamberlain P, Devanaryan V, et al. Anti-drug Antibody Validation Testing and Reporting Harmonization. AAPS J. 2021 Dec 1;24(1):4. doi: 10.1208/s12248-021-00649-y. PMID: 34853961; PMCID: PMC8816448.
[6] Amaravadi L, Song A, Myler H, Thway T, Kirshner S, Devanarayan V, et al. 2015 White Paper on recent issues in bioanalysis: focus on new technologies and biomarkers (Part 3--LBA, biomarkers and immunogenicity). Bioanalysis. 2015 Dec;7(24):3107-24. doi: 10.4155/bio.15.226. Epub 2015 Dec 4. PMID: 26635247.
[7] Tan CY, Steeno GS, You Z, Gaitonde P, Cai CH, Kamerud J,et al. Criteria to Reevaluate Anti-drug Antibody Assay Cut Point Suitability in the Target Population. AAPS J. 2020 Jan 3;22(2):19. doi: 10.1208/s12248-019-0400-4. PMID: 31900604.
来源：迈杰转化医学
