摘要：在口腔颌面部这个小小的区域，复杂的组织结构支撑着我们日常的咀嚼、吞咽和语言功能。但当这些组织受到疾病侵袭时，如何精确地模拟和研究这些病变，以寻找更有效的治疗方案呢？一项新兴技术——类器官技术，正在为我们揭开这一领域的新篇章。让我们一起走进实验室，探索这些微型但
在口腔颌面部这个小小的区域，复杂的组织结构支撑着我们日常的咀嚼、吞咽和语言功能。但当这些组织受到疾病侵袭时，如何精确地模拟和研究这些病变，以寻找更有效的治疗方案呢？一项新兴技术——类器官技术，正在为我们揭开这一领域的新篇章。让我们一起走进实验室，探索这些微型但功能强大的“人体模拟器”——口腔颌面类器官，它们是如何帮助科学家们攻克医学难题的。
文章介绍
题目：口腔颌面部类器官：现状与未来
杂志：International Journal of Oral Science
影响因子：IF=10.8
发表时间：2024年11月
#1
研究背景
Background
口腔颌面部区域由多种软硬组织构成，易受创伤、炎症和癌症等病理因素影响。这些疾病不仅影响患者的生活质量，治疗过程中还可能损害口腔颌面部结构，影响基本生理功能。传统研究方法，包括2D细胞培养、动物模型和永生化细胞系，因种属差异、缺乏细胞间相互作用和表型漂移等问题，限制了模拟人类病理状态的准确性和可靠性，尤其在复制肿瘤的复杂性和异质性方面。
类器官技术利用干细胞的自我更新和分化能力，模拟复杂组织结构和功能，为研究口腔颌面部疾病提供新视角。通过构建和表征口腔颌面类器官，研究者希望深入理解疾病机制，开发有效治疗策略。此外，类器官技术在个性化医疗和药物筛选中的应用潜力，为探索新疗法和提高治疗效果提供了新动力。
#2
研究结果
Results
1. 口腔颌面类器官的构建与表征
1.1 构建口腔颌面类器官的三个关键要素
口腔和颌面类器官可由小鼠和人细胞生成，其生长和分化受支撑支架和补充分子影响，模拟体内环境。牙齿、唾液腺等组织类器官已有研究，但骨及疾病类器官需进一步探索。干细胞来源、支持支架和补充分子是构建这些类器官的关键要素（图1）。
图1
1.1.1 干细胞
ASC或PSC能自我更新和多能分化，可用于构建模拟祖组织分化谱系的类器官。口腔颌面部器官的ASC已成功用于构建多种类器官，如牙齿、口腔癌和唾液腺类器官。PSC，包括ESC和iPSC，也可用于构建口腔类器官，如唾液腺雏形、牙齿和骨骼类器官。
1.1.2 支持支架
外基质是口腔类器官的核心组成部分之一，为干细胞提供结构支持和介导指导性信号。天然水凝胶如Matrigel是主要选择但存在局限，而合成支架如PEG、PCL、PLGA具有优越机械性能。天然衍生聚合物如明胶、HA等与天然ECM具有生物相容性和结构相似性，也是类器官培养常用的基质材料。混合水凝胶结合天然与合成材料优势，有效地融合了天然材料和合成材料的优点。脱细胞细胞外基质（dECM）提供替代选择，但脱细胞方法各异，缺乏统一方法。dECM水凝胶已用于类器官培养，但需拓展其生物力学性能，引入多种材料以确保类器官构建与生长的多样性和适应性。
1.1.3 补充分子
口腔和颌面类器官培养方案各异，补充分子产生方式具有内容依赖性。不同组织和干细胞来源的类器官对生态位因子需求不同，且需控制外源分子添加的时间和顺序。总之，口腔颌面部类器官生长的最佳条件需根据具体情况而定（图2）。
图2
1.2 类器官的表征策略
类器官系统需在形态、基因表达和功能水平上进行表征，以评估其对组织和微环境的模拟程度。传统表征策略包括组织学、显微镜、免疫荧光和基因表达测定，但这些方法有限。新成像技术和数据分析方法提供了更深入的观察，而单细胞测序技术如scRNA-seq在细胞类型和基因表达模式上提供了更精确的比较。多组学技术的发展，如结合表观基因组学、转录组学等，进一步促进了类器官的表征。在功能表征方面，例如牙齿类器官需检测钙的形成，而唾液腺类器官则通过移植到动物体内测试其功能，这些方法有助于评估类器官的成熟度和功能。
2. 改进共培养技术以产生组装式类器官
支架和/或分子的补充只能模拟单一变量情景下的信号激活或失活，而不能为干细胞提供由基质细胞、血管网络和免疫微环境组成的生态位。多种生物工程技术被用于构建类器官-基质细胞共培养体系，也称为组装式类器官。
2.1 细胞团共培养
共培养方法分为两步：首先通过悬浮培养产生球状体，即细胞团，常采用低粘附表面培养法，促使细胞形成簇，进一步发展成类器官。这种方法有利于干细胞生长和分化，但难以控制细胞簇大小和追踪单个细胞簇生长。其他形成簇的方法包括吊滴法和旋转烧瓶法，后者通过搅拌防止细胞粘附，促进营养分布。其次，不同干细胞形成的细胞团或类器官可共接种到同一培养体系中，辅以生长信号分子，形成组装式类器官。这种技术为细胞间直接相互作用提供平台，如Harter等人将肠道类器官和PBMC共包封在3D水凝胶中，模拟免疫过程。Yang等人利用共接种技术建立了模拟口腔黏膜下纤维化的血管化成纤维细胞附着类器官模型。
2.2 气液界面（ALI）技术
ALI技术已成为生成多种上皮类器官的有效方法，包括肾、脑、胃肠道、肺和气道类器官。与细胞簇共培养相比，ALI技术提供了更好的氧合，促进了类器官生长，并增强了细胞间的相互作用。Neal等人利用改进的ALI技术共培养原代肿瘤上皮与免疫细胞，成功模拟了肿瘤免疫微环境。类似地，研究人员利用ALI技术研究了人气道上皮细胞和肺微血管内皮细胞之间的相互作用，以及构建了模拟慢性鼻窦炎的组装式类器官模型。Takeuchi等人通过将胰腺癌患者细胞与hiPSC来源的间充质细胞和内皮细胞共培养，成功生成了胰腺癌类器官。这些研究表明，基于ALI技术的共培养系统能够有效构建包含上皮细胞和其他基质细胞的组装式类器官。
2.3 微孔阵列技术
微孔阵列技术能够控制细胞聚集和类器官的大小与形态，已被应用于生成多种类器官，如胰腺、肠道、肾脏和肝脏类器官。尽管如此，该技术在口腔和上颌组装式类器官的构建中应用较少。Kakni等人开发的基于微孔的肠道类器官-巨噬细胞共培养系统，显示了巨噬细胞能在微孔内表面附着并维持正常表型。这一模型不仅增进了对肠道内稳态和紊乱机制的理解，也为未来构建口腔和上颌组装类器官提供了新的技术途径。
2.4 3D生物打印技术
生物3D打印技术因其在精确控制类器官的组成、空间分布和结构方面的能力，正成为生物工程和再生医学领域的一种常用方法。这项技术通过使用含有特定细胞、ECM和其他成分的生物墨水，能够精确制造不同尺寸和结构的类器官。例如，无喷嘴声滴打印技术已被用于构建口腔癌组装类器官，而磁性生物3D打印技术利用磁性纳米颗粒标记细胞，通过磁点阵列快速生成三维球体，进而制造出具有神经支配的分泌性上皮类器官，如从人牙髓干细胞衍生的唾液腺样类器官。
2.5 微流控装置
微流控装置在研究细胞间相互作用和促进类器官血管化方面发挥着重要作用，它们通过提供涂有ECM分子的微流控通道来促进细胞粘附和类器官形成。器官芯片技术允许不同细胞类型的共培养，为模拟复杂生物环境提供了可控环境。例如，血管化肝类器官的构建和人脑类器官微生理分析平台的建立，后者模拟了神经免疫相互作用。这些进展展示了结合器官发育理论、先进ECM材料和生物工程技术在创建实用和精确的组装式类器官模型中的潜力。
3. 使用口腔和颌面组织生成组装式类器官的策略
口腔颌面部类器官的组装因其包含软硬组织而更为复杂，需要综合生物和工程方法。本综述回顾了现有文献中关于从口腔颌面组织（包括牙齿和软组织）构建组装类器官的研究（表1），并分析了基于现有骨类器官构建知识，评估了生成颌骨类器官的可能性。
表1
3.1 牙齿类器官
牙齿作为人体中最坚硬的矿化器官，包含牙釉质、牙本质、牙骨质和牙髓等不同硬度的成分，复制天然牙齿的复杂性极大。牙齿类器官的发展旨在模拟天然牙齿的硬度和弹性模量，为血管化和神经再生提供空间。牙齿类器官已成为研究牙髓炎、根尖牙周炎、牙周炎等疾病的关键模型。
牙髓是高度血管化、神经支配的结缔组织，模拟天然牙髓微环境对诱导牙髓样结构的类器官至关重要。通过人牙髓源性ECM技术，建立了模拟牙髓组织的三维类器官模型，并将人牙髓细胞与内皮细胞共培养形成功能性类牙髓器官。预血管化牙髓类器官的建立有助于阐明牙髓形成中血管生成的机制。未来的研究需加入神经细胞和免疫细胞以优化模型。
牙齿类器官的形成依赖于上皮和间质的相互作用，近年来研究集中在牙胚类器官的形成上。Hemeryck等人从未长出智齿的人类牙毛囊组织中提取上皮类器官，与牙间充质细胞结合形成组装的类器官，诱导成釉细胞分化和牙釉质形成。利用牙髓干细胞（DPSC）和牙周韧带干细胞/祖细胞（PDLSC）共培养构建了牙根类器官。
尽管目前各种牙类器官的培养策略还不能完全复制整个牙齿结构，但这些策略的进展体现了牙髓类器官和牙胚类器官向结构良好的生物工程牙齿的转变。有必要探索更有效的培养方法，以促进疾病模拟和牙体再生的发展。
3.2颌骨类器官
颌骨，包括上颌骨和下颌骨，是由矿化的骨组织、骨髓以及血管和神经构成的复杂结构。骨缺陷通常由骨折、骨髓炎或肿瘤等疾病引起，而传统治疗方法如自体或同种异体骨移植受限于可用性并可能引起生物反应。因此，研究者们开发了多种骨骼系统类器官，模拟体内骨骼发育以实现骨再生，这些类器官在治疗口腔骨组织疾病方面展现出潜力。
尽管现有骨骼类器官能展示骨的形成、吸收或造血等功能，但它们未能完全再现骨生态位中的动态过程，且在口腔骨组织疾病治疗中的应用有限。考虑到骨骼发育的相似性，骨骼类器官和骨再生医学在口腔颌面疾病治疗中具有应用前景。这些类器官的培养依赖于干细胞、支架和信号分子，且对支架的机械和生化特性有特别要求。Matrigel因其机械特性差而受限，而胶原蛋白、明胶和脱矿骨基质是更合适的选择。内源性和外源性信号如BMP2和RANKL在成骨和破骨细胞分化中起关键作用，而持续的机械负荷也对骨骼器官发生有积极影响。
目前已成功开发多种骨骼类器官。血管内皮细胞的加入有助于模拟血管化组织结构，而通过3D生物打印技术成功生产的神经-骨结构显示出作为神经支配骨类器官的潜力。颞下颌关节类器官研究相对缺乏，但通过结合骨和软骨细胞衍生物与内皮细胞，构建了“迷你关节”模型，为颞下颌关节疾病研究和治疗提供了新方向。骨骼类器官的发展仍处于初级阶段，其在再生医学中的应用需要进一步研究，以解决伦理问题、培养周期和免疫原性等挑战。
3.3口腔癌和粘膜类器官
口腔癌类器官为肿瘤学研究、疾病模拟、药物开发和精准治疗提供了新的平台，需要更精确地模拟肿瘤微环境（TME），以保留肿瘤细胞的遗传、分子、结构和功能特征。
口腔粘膜类器官不仅能作为个性化癌症治疗的平台，还能模拟病毒感染后的病理生理变化。研究已证实HSV1和HPV16能有效感染口腔粘膜类器官，为模拟病毒相关疾病如口腔疱疹提供了模型。HPV感染的口腔粘膜类器官为研究肿瘤细胞在致癌过程中的遗传变化和细胞与微环境的相互作用提供了新的途径。此外，通过共培养人牙龈上皮细胞、成纤维细胞和微血管内皮细胞（mvEC），研究者成功生成了血管化前的口腔粘膜等量细胞，为构建用于口腔癌研究的组装式类器官提供了新思路。口腔鳞癌（OSCC）通常起源于癌前病变，如口腔粘膜下纤维化、白斑和红斑，但对这些病变的研究有限，且模型多集中在二维细胞培养。未来的类器官模型可能有助于阐明这些癌前病变恶性转化的机制。
研究表明，癌症相关成纤维细胞（CAF）与口腔癌类器官共培养能提高癌症类器官的寿命，并促进原发OSCC细胞的干细胞特性，增强类器官形成能力。CAF的存在也增加了癌细胞的侵袭性，未来的研究可能会揭示由OSCC细胞、CAF和内皮细胞（EC）组成的高效三位一体的组装类器官，为肿瘤类器官的血管化提供新的可能性。
利用iPSC分化的EC可以增强肿瘤组装类器官的细胞来源，而3D打印、微流控技术等工程手段有助于构建血管化肿瘤类器官。免疫细胞浸润口腔癌类器官可能是下一个研究方向。患者源性类器官异种移植模型通过结合体外类器官研究与动物模型，为精准医学领域提供了有前景的途径，尤其在筛选抗肿瘤药物、识别生物标志物、个性化治疗等方面发挥着重要作用（图3）。
图3
3.4 其他软组织类器官
口腔颌面部软组织器官的研究中，唾液腺和舌头的组装类器官相对较少。间充质细胞如BM-MSC可诱导唾液腺上皮类器官形成，而DPSC可能促进腺泡细胞分化，为组织再生提供新途径。尽管微血管内皮细胞 (mvEC)与唾液腺细胞共培养可促进血管化，但不足以形成功能网络。Soto-Gamez等人通过共培养脂肪来源的间充质干细胞和唾液腺类器官促进干细胞扩增。
味觉类器官和舌上皮类器官的研究多集中于单独构建而非组装。味觉存在于部分舌乳头中，一项研究将类味觉器官移植至小鼠舌上皮，发现其有植入和神经支配潜力。scRNA-seq显示其含多种舌上皮细胞、味觉受体细胞、味觉前体细胞和味觉干细胞。味觉类器官已被用于构建辐射性口腔黏膜炎模型并得到验证。
4. 构建口腔颌面类器官的局限性和挑战
4.1 口腔和颌面类器官的血管化
典型的类器官系统缺乏脉管系统，限制了其在全面疾病建模中的应用。为了解决这一问题，研究人员尝试将血管内皮细胞整合到类器官中，以促进血管结构的形成，并利用微成型、微流体、3D打印等技术在体外构建血管样结构。尽管已有初步成果，但类器官血管化的实际应用仍面临挑战，需要考虑内皮细胞的特异性，并探索其他来源的内皮细胞以提供更个性化和精确的治疗。
血管系统的发育涉及不仅是内皮细胞，还包括壁细胞等，它们为类器官血管生成提供结构和功能支持。基因编辑技术的应用可以提高微血管的稳定性。目前，血管化类器官研究集中在血供丰富的器官，而口腔颌面类器官的研究还需深入。血管化类器官对模拟肿瘤微环境、提供营养、促进癌细胞转移和影响免疫细胞功能至关重要，有助于疾病研究和治疗。构建多层仿生血管和自组装血管网络，为血管化类器官的发展提供更全面的平台，是未来研究的重要方向（图4）。
图4
4.2 免疫细胞整合到口腔和颌面类器官
在口腔疾病，尤其是牙周炎和OSCC中，免疫细胞在疾病微环境中扮演着双重角色，既促进又抑制疾病进展。然而，由于缺少完整的免疫微环境，体外疾病建模和药物筛选面临挑战，依赖于体内模型，而这些模型需要长时间才能稳定。类器官技术的进步为癌症相关免疫系统的个体化建模提供了新策略。在PDO模型中，免疫-肿瘤微环境可以通过共培养肿瘤细胞与免疫细胞、保留天然肿瘤浸润性免疫细胞或将PDO移植到动物模型中来构建。这些方法在模拟肿瘤微环境中的免疫反应方面具有潜力。
尽管如此，免疫细胞与口腔类器官的整合仍有一些问题，包括水凝胶结构对免疫细胞浸润的影响，以及缺乏适用于免疫细胞和类器官的通用扩增培养基。在共培养之前，需要精确实验以确定最佳培养基，确保免疫细胞和类器官的共存与增殖。此外，模拟免疫环境和类器官与免疫环境之间的相互作用是类器官研究的另一个挑战。结合免疫和其他基质成分的PDO有助于实现精准医疗和个性化治疗的目标。
4.3 基因编辑
基因编辑技术在类器官应用中面临脱靶效应、免疫原性和细胞毒性等挑战。与2D培养相比，类器官培养的复杂条件增加了基因编辑剂输送的难度。未来研究需提升CRISPR在干细胞中的安全性和效率，优化编辑剂递送，以充分发挥基因编辑技术在揭示疾病复杂性方面的潜力。
5. 口腔颌面类器官的临床应用
本节总结了上述口腔颌面组装类器官在疾病模拟领域的应用（图5）。
图5
5.1 牙齿类器官
人类牙齿一旦形成，成釉细胞会凋亡，导致无法自我修复受损的牙釉质，影响咀嚼并可能引起牙齿脱落。种植牙是目前的替代方案，但存在并发症风险。牙齿再生工程的进展有望带来生物工程牙齿，取代传统种植体。尽管目前的牙胚类器官尚未能在体外形成成熟牙齿，但移植后能产生功能牙齿。研究人员正在探索体外诱导牙釉质形成的牙齿类器官模型，以促进牙齿再生医学的发展。Hemeryck等人的研究表明，DPSC能促使上皮干细胞分化为成釉细胞，而hAO在与小鼠牙间质相互作用时显示出牙齿再生的潜力。ieAM类器官在体外和体内移植后均能表达矿化所需的牙釉质必需蛋白，为牙髓-牙本质再生带来希望，但临床应用还需进一步研究。
5.2 唾腺类器官
唾液腺再生技术为解决衰老、损伤、Sjögren综合征和放射治疗引起的唾液分泌障碍提供了新途径。研究人员利用传统细胞培养或先进的3D生物打印技术成功培养出能分泌唾液的唾液腺类器官，这些类器官移植后能显著促进受损腺组织上皮和神经元的再生。利用这些类器官，可以研究干细胞辐射应答机制，模拟辐射损伤导致的唾液分泌不足，为头颈癌放疗患者提供更好的治疗方案。Yoon等人开发的长期类器官培养方法为唾液腺再生医学提供了重要工具。
5.3 口腔粘膜和味觉类器官
口腔粘膜类器官为研究癌前病变如口腔白斑、红斑和口腔黏膜下纤维化（OSF）提供了新的研究途径，有助于早期诊断和治疗。血管化成纤维细胞附着类器官（vFAO）模型在研究OSF发病机制方面显示出潜力，而Salahudeen等人的研究揭示了DYRK2激酶在口腔粘膜类器官中的致癌作用，为靶向治疗和早期诊断提供了新见解。味觉丧失对患者生活影响巨大，味觉类器官的研究为解决这一问题带来希望，Wu等人构建的味觉类器官芯片系统有望促进疾病建模和药物筛选。
5.4 口腔癌类器官
PDO作为连接动物模型和人体临床试验的桥梁，能忠实反映患者的生理病理状态，成为个性化药物测试模型。它们帮助临床医生选择更合适的治疗方案，优化疗效，减少副作用。在口腔颌面肿瘤研究中，如Driehuis等人所展示，PDO被用于建立类器官模型，用于药物筛选和新药开发，显示出高预测准确率。Czerwonka等人利用PDO测试了Notch调节剂的疗效，而Ishikawa等人证实PDO可用于验证致癌途径激活和测试基因型引导的分子靶向治疗，提高精准医学疗效。这些研究展示了PDO模型在口腔颌面部肿瘤研究中的多样化应用，为未来优化个性化医疗和治疗策略提供了新前景。
#3
研究结论
Results
本综述揭示了类器官技术在模拟和研究口腔颌面部疾病中的重要作用。文章总结了如何利用干细胞技术构建出能够模拟牙齿、唾液腺、粘膜等多种口腔颌面部组织的类器官模型。这些模型不仅能够重现组织的复杂结构和功能，还能在药物筛选、疾病机制研究以及个性化医疗中发挥关键作用。特别值得一提的是，通过改进的共培养技术，研究者们能够更准确地模拟肿瘤微环境，为口腔癌等疾病的研究提供了新的平台。总的来说，类器官技术的发展为我们深入理解口腔颌面部疾病的复杂性、开发新疗法以及实现精准医疗带来了新的希望。
参考文献
Wu Y, Li X, Liu H, Yang X, Li R, Zhao H, Shang Z. Organoids in the oral and maxillofacial region: present and future. Int J Oral Sci. 2024 Nov 1;16(1):61. doi: 10.1038/s41368-024-00324-w. PMID: 39482304; PMCID: PMC11528035.
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来源：培养盒守护者
