摘要：这是我们目前澄清过滤收获经常遇到的一些问题，我们将在下文为您详细阐述解决方案。想了解生物技术研究、开发和生产内容可以去默克www.sigmaaldrich.cn查看
01:高密度低活率的收获液,怎么办?
Q2:常规过滤细胞出现裂解,导致二硫键断裂，怎么办?
这是我们目前澄清过滤收获经常遇到的一些问题，我们将在下文为您详细阐述解决方案。想了解生物技术研究、开发和生产内容可以去默克www.sigmaaldrich.cn查看
细胞发酵概览
随着上游培养技术的快速发展，高密度高表达的细胞培养带来更高的生产效率和更低的工艺成本, 越来越受到大家追捧。随之而来为收获步骤带来一些新的挑战:
高密度：料液细胞密度在20x106cells/mL以上
低活率：常规料液的活率在85%以上，部分料液活率在60-85%
高固含量：常规料液的固含量在5-10%，部分料液固含量在10%以上
面对以上复杂料液的情况，常规深层过滤器或收获方式容易造成堵塞快，载量低等问题，带来设备、厂房或耗材成本等挑战。
那么，面对这些挑战料液带来的收获步骤的工艺挑战，我们有哪些新思路？
图1：澄清过滤流程图
敏感细胞料液裂解
相对于单抗，双抗或者三抗具有一些非自然结构，稳定性和结构更易出现问题。有文献表明澄清过滤过程中细胞的裂解和操作压力的压差息息相关，在压差为8-10Psi开始发生细胞裂解，压差在13-30Psi，发现出现细胞LDH和硫醇水平的平台，表明细胞基本全部裂解。
图2：压力对于细胞裂解的影响
图片源自DOI:10.1016/J.SEPPUR.2014.12.002
对压差敏感料液，为了控制细胞较少裂解，导致过滤载量低。Merck推出了SP系列全人工合成滤器，具有更强容污和电荷吸附能力，在较低剪切力和压差的情况下获得更高的过滤载量和更好的料液质量。某客户料液对压力较为敏感，常规滤器控制压差低于8-10Psi，此压力条件下过滤载量未能满足需求，测试Merck D0SP+X0HC滤器组合，一级深层滤器D0SP载量为141L/m2，压力为9Psi，载量2.2倍于常规滤器D0HC，D0SP的阻力系数远低于D0HC。D0SP滤器相比较D0HC具有更低的剪切力和更高的载量，二级滤器X0HC均具有较好的过滤载量。
低活率细胞料液
面对料液活率在60-80%之间的低活率料液，常规滤器载量较低的情况下，建议考虑絮凝结合深层滤器的方案。相关文献表明，在低活率（Mab1活率37%和Mab2活率70%）的条件下， pDADMAC+Clairsolve深层滤器的组合载量＞350L/m2，收率＞90%，除此之外，絮凝预处理对于DNA具有较高的去除率（＞3log10和＞5log10）。当然，过滤的载量和去除杂质的效果与细胞密度和活率息息相关，料液状态不同会有不同的表现，但是pDADMAC+Clairsolve 组合是面对极端挑战性料液的最直接和有效的方法之一。
图3：不同比例pDADMAC添加后料液粒径分布
图片源自DOI.org/10.1016/j.seppur.2014.12.002
pDADMAC安全性：1ppm作为目标pDADMAC的残留水平
pDADMAC有效去除：下游工艺有效去除pDADMAC，残留水平降至1ppm以下
pDADMAC检测方法：HPLC或表面等离子共振SPR方法检测
根据絮凝案例的数据和相关发表文献，絮凝的方式也能够有效地去除HCP和DNA，减轻后续纯化步骤的杂质去除压力。
小结
对于澄清过滤中细胞裂解的问题，推荐吸附性和剪切力更小的SP系列膜包；对于活率较低或细胞密度较高的料液，推荐使用pDADMAC+Clairsolve系列滤器组合的方式。但是不同项目的澄清收获料液的表现不同，有时相同项目的发酵液状态也有很大差异，比如培养基发生了改变。因此，澄清收获液的不可预测性、料液的复杂性是下游澄清过滤的重大挑战。
图4：料液推荐测试方案
文章中提到的默克滤器具体信息如下：
针对以上情况，Merck澄清过滤面对挑战性料液解决方案如下：
Millistak+® HC Pro系列滤器
创新型的全人工合成过滤介质
冲洗要求低，载量高，HCP和DNA去除能力优异
絮凝+Clarisolve®系列滤器
需要预处理：pDMADAC絮凝处理或者酸沉淀
梯度密度结构，孔径范围更广，不易堵塞
参考：
1. Sladjana Tomic, Lise Besnard, Christian Hakemeyer. Complete clarification solution for processing high density cell culture harvests .Separation and Purification Technology
Volume 141, 12 February 2015, Pages 269-275.
2. Brian O'Mara,Zhong-Hua Gao et al. Impact of depth filtration on disulfide bond reduction during downstream processing of monoclonal antibodies from CHO cell cultures. Biotechnol Bioeng,2019 Jul;116(7):1669-1683.
3. Matthew Westoby,James Chrostowski,et al. Effects of Solution Environment on Mammalian Cell Fermentation Broth Properties: Enhanced Impurity Removal and Clarification Performance. Biotechnology, 1 September 2010.
来源：不能胖胖胖
