摘要：虽然肿瘤类器官通过在体外重现真实肿瘤的细胞结构和行为而彻底改变了癌症研究，但功能性血管系统的缺乏阻碍了其完整的生理能力。复旦大学刘妍君和陈飞团队提出了一种创新的血管化患者源性肿瘤类器官（PDTO）芯片。研究发现，高转移性肿瘤细胞诱导血管生成，同时通过Notch
虽然肿瘤类器官通过在体外重现真实肿瘤的细胞结构和行为而彻底改变了癌症研究，但功能性血管系统的缺乏阻碍了其完整的生理能力。复旦大学刘妍君和陈飞团队提出了一种创新的血管化患者源性肿瘤类器官（PDTO）芯片。研究发现，高转移性肿瘤细胞诱导血管生成，同时通过Notch途径向血管迁移。PDTO的血管生成和迁移能力与其临床转移结果之间的明显关联强调了评估肿瘤转移的创新平台的潜力，从而为临床决策提供了有价值的见解。该系统还能推进对肿瘤转移的理解，并根据患者特定的肿瘤特征制定个性化的治疗策略。
文章介绍
题目：Personalized Vascularized Tumor Organoid-on-a-Chip for Tumor Metastasis and Therapeutic Targeting Assessment
杂志：Advanced Materials
影响因子：27.4
发表日期：2024年12月
#1
研究背景
Background
肿瘤转移这一复杂的多阶段过程是由癌细胞与肿瘤微环境（TME）之间严格调控的相互作用驱动的，包括转移相关信号通路、肿瘤血管生成、代谢变化、免疫调节和机械力。其中，肿瘤血管生成仍然是长期公认但知之甚少的癌症标志。随着研究不断解开这种肿瘤血管的复杂性，迫切需要推进个性化的翻译模型，以深入探索肿瘤-TME相互作用并确定阻断肿瘤转移的新靶点。
从患者来源的肿瘤组织中培养形成类器官，保留了遗传，蛋白质组学，形态学和药理学特征，解决了传统上需要动物模型的组织动力学的高层次问题；然而，类器官的一个重要限制是缺乏功能性血管系统，这对于营养和氧气供应以及肿瘤转移至关重要。尽管使肿瘤类器官血管化取得了一些进展，但关键的挑战仍然在于开发一种研究平台，包括异质肿瘤类器官内定义良好的血管网络，以及实时，宽视野和长期动态监测能力。
基于微流体技术的器官芯片（OoC）在模拟人体生理条件、实现高时空分辨率的动态成像和分子分析方面表现出强大的能力。然而，现有的肿瘤血管芯片，主要来源于细胞系，未能充分捕获实际肿瘤的异质性。因此，迫切需要开发更具生物学准确性的模型。将PDTO整合到这些模型中可以显著增强其生理相关性。在芯片上血管化PDTO的常见策略涉及简化肿瘤微血管系统的复杂性，其特征在于具有可灌注管腔的微血管（MV）和复杂的肿瘤诱导的血管生成。然而，不同特性的血管在肿瘤的生长、发展和转移中发挥着独特的作用，并对抗血管生成药物表现出不同的反应，这极大地影响了治疗效果和耐药性。因此，在PDTO内重建一个层次性和多样性的肿瘤特异性微血管系统对于提高这些模型的保真度和实用性是必不可少的。
#2
研究思路
Methods
首先构建人肿瘤血管周围微生态位芯片（hTPV）；然后培养高转移潜力的MNNG/H骨肉瘤（OS）肿瘤球和低转移能力的U2OS肿瘤球来探究肿瘤细胞在hTPV芯片上的不同生物学行为；接着从有和没有肺转移的OS患者的原发性肿瘤构建了血管化PDTO，并在5天后移植到具有MV的hTPV芯片上，产生体外3D血管周围小生态；再使用VEGFR2抑制剂阿帕替尼来确定导致MV诱导的肿瘤球定向迁移的关键因素和阿帕替尼对来自转移性肿瘤患者的PDTO的有效性；最后比较由MV显著上调和由VEGFR2抑制剂治疗下调的基因来深入研究血管生成对肿瘤迁移的分子动力学。
图1 血管化患者源性类器官（PDTO）研究示意图。
#3
关键研究结果
Results
1、人肿瘤血管周围微生态位芯片的重建
本研究开发了一种仿生hTPV芯片上的小生态。该芯片集成了四个独立但相互连接的重复功能单元，为并行实验提供了四个统一的场所。每个单元包括一个用于MV自组装的MV微通道、一个用于装载肿瘤球状体的开顶腔室和一个用于营养供应的培养基通道，所有这些都共用一个MV微通道入口（图2a）。还设计了一个梯形微柱阵列来分隔相邻的微通道以确保独立的微通道操作，同时允许营养渗透。由于表面张力，梯形柱之间形成毛细破裂阀，促进了细胞负载水凝胶的填充，并限制了它们泄漏到相邻通道中，从而产生了清晰的气液和固液界面（图2b，上图）。柱之间的100 μm间隔允许细胞相互作用、营养交换和旁分泌提示。此外，还集成了一个梯形柱，其长度延长（550 μm），作为压力稳定器，以增强芯片注入过程中的稳定性（图2a）。将纤维蛋白原包封的内皮细胞（EC）和成纤维细胞移液到中央通道中，以在芯片上形成血管（图2a）。由于压力稳定器的优化设计，凝胶保持完全限制在微通道内，确保加载期间细胞的均匀分布（图2b，上图）。
研究显示，EC在第6天开始自组装成微血管结构（图2b，底部）。MV表现出分级尺寸分布，小管腔轴范围从几微米到几十微米不等，与体内毛细血管到微血管的生理尺寸一致（图2cd）。检测了内皮细胞和血管的关键标志物内皮粘附分子VE-钙粘蛋白和内皮细胞间连接组分CD31的表达以评估自组装MV的功能。免疫荧光结果显示MV上VE-钙粘蛋白和CD31的广泛表达，证实了新形成MV的功能性（图2ef）。通过横截面共聚焦成像和3D重建，观察到MV内3D中空血管腔的形成（图2fg）。这些发现共同验证了hTPV芯片构建了具有功能性的、可灌注的管状结构的仿生MV。
在第9天，当MV变得成熟和稳定时，将肿瘤球加载到顶室中（图2a）。当在hTPV芯片上将肿瘤球与MV共培养时，观察到以MV网络内肿瘤诱导的血管生成为特征的异质微血管系统的自发形成（图2h）。响应于肿瘤诱导的血管生成而形成的血管明显小于预先存在的MV网络中的血管（图2i）。脉管系统的形态的定量分析结果显示，与更有组织和均匀排列的MV网络相比，肿瘤诱导的血管生成区域中新形成的芽更加无序和不规则，显示分形维数、平均空隙度和SD值增加（图2jk）。这些结果说明hTPV芯片作为一个仿生分层的血管肿瘤系统，能准确地模仿异常血管生成中观察到的肿瘤。
图2 利用hTPV芯片上的肿瘤球重建三维异质性血管小生态。
2、不同转移潜能肿瘤细胞在hTPV芯片上的不同行为
为了探究肿瘤细胞在hTPV芯片上的不同生物学行为，研究人员培养了高转移潜力的MNNG/HOS肿瘤球和低转移能力的U2OS肿瘤球。结果发现这些球状体类型和微血管之间的相互作用模式具有显著差异。MNNG/HOS肿瘤球与微血管网络的结合更加紧密，形成了U2OS组中不存在的动态相互作用（图3a）。MNNG/HOS肿瘤球表现出更大的移动性，主动向MV迁移，8天后平均移动600 μm，而U2OS肿瘤球基本保持不动（图3b-e）。
MNNG/HOS组显示出显著的血管化，MNNG/HOS肿瘤球诱导了血管连接数量和连接密度的显著增加，说明了肿瘤迁移诱导血管生成。相反，U2OS组未表现出任何明显的肿瘤诱导的血管生成或血管生长（图3f）。此外，在MNNG/HOS组中的肿瘤细胞表现出显著的多功能性，可沿血管结构爬行、穿透血管腔（图3gh）、在血管腔内运输（图3i），并最终从血管外渗。这些观察结果突出了这一模型在实时、可视化跟踪肿瘤转移的时空异质性方面的优势。总的来说，MNNG/HOS肿瘤球具有较高的转移潜能，不仅能促进血管生成，还能促进微血管结构的生长。这些球状体集体向MV迁移，而个别肿瘤细胞浸润血管腔。肿瘤细胞与微血管之间密切而频繁的相互作用为随后的肿瘤转移创造了有利的环境。
图3 具有较高转移潜能的MNNG/HOS细胞诱导血管生成并向MV迁移。
3、在hTPV芯片上构建血管化PDTO
研究人员从有和没有肺转移的OS患者的原发性肿瘤（图4a）构建了血管化PDTO（图4b）。通过活检获得新鲜肿瘤组织，经过组织消化、细胞分散、过滤和离心重悬过程分离活的患者来源的细胞（PDC）。利用PDC生成PDTO。HE和免疫组化染色表明这些PDTO的肿瘤基质中有骨基质形成，SATB2和波形蛋白表达呈阳性，与其母肿瘤标本非常相似（图4c）。此外，SSEA4和β-SMA的免疫荧光染色结果显示，原发组织和PDTO均表现出异质性，SSEA4阳性细胞（未分化肿瘤干细胞的亚群）主要位于PDTO外周，表明骨肉瘤PDTO保留了原发肿瘤的生物学特性，包括关键功能蛋白的表达，异质性肿瘤细胞亚群的存在，以及肿瘤组织的多样性细胞成分。
PDTO在体外建立5天后移植到具有MV的hTPV芯片上。MV复杂地包裹并穿透PDTO，产生了体外3D血管周围小生态，与临床肿瘤标本中观察到的TME非常相似（图4d）。在共培养8天后，只有在来自转移性患者的PDTO中，由PDTO诱导的具有异常发芽的无序血管的剧烈形成（图4e）。第8天的定量血管分析显示，用来自转移性组的PDTO培养的MV的连接数和密度均显著增加，表明转移性PDTO诱导血管生成的能力更高（图4f）。仅在来自转移性肿瘤的PDTO中朝向MV的一致定向移动，而非转移性类器官表现出有限和非定向迁移（图4g）。
值得注意的是，在研究的所有5名患者中，芯片上PDTO的血管生成和迁移能力与转移活性的临床评估完全一致，这表明芯片在评估肿瘤转移潜力以指导临床治疗决策方面具有实用性。研究结果强调了hTPV芯片的长期培养和动态血管化的类器官形成的实时监测的优势。作为一个有价值的平台，hTPV芯片具有很好的应用前景，用于破译肿瘤细胞和周围血管系统之间复杂的细胞串扰，以及解决肿瘤-血管界面上定义不清的分子相互作用。深入了解这些相互作用将增强对PDTO内血管结构如何影响抗癌治疗的递送和疗效以及癌症转移的潜在机制的理解。
图4 PDTO的血管生成和迁移能力与其转移能力之间呈正相关。
4、抗血管生成药物的治疗试验
为了确定导致MV诱导的肿瘤球体定向迁移的关键因素，使用阿帕替尼（一种VEGFR2抑制剂）来中断新生血管形成。研究精确监测了将阿帕替尼引入含有肿瘤球的培养基后10天内肿瘤血管周围小生态内发生的动态变化（图5a）。在芽的远端观察到许多丝状伪足样内皮尖端细胞，即负责血管出芽的运动细胞，向肿瘤球延伸（图5b，上图）。然而，阿帕替尼治疗后，这些血管芽变得失活并逐渐缩回，内皮尖端细胞随时间消失（图5b，下图）。
定量分析显示，在药物干预的情况下，芽中的血管长度、外植体面积和连接数显著减少（图5c）。相比之下，成熟MV网络受到的影响最小，仅表现出轻微的收缩（图5d）。这些结果与临床观察结果一致，阿帕替尼有效抑制肿瘤诱导的血管生成，而不显著影响成熟MV（图5e）。这进一步说明了这一模型在阐明分级血管对抗血管生成药物的不同反应方面的能力，为靶向治疗的发展提供了有价值的启示。此外，它突出了hTPV芯片作为临床前药物筛选和个性化医疗应用平台的潜力。
图5 VEGFR2抑制剂抑制肿瘤诱导的血管生成而不影响成熟的MV。
5、MV通过Notch途径诱导类器官迁移
从单独培养或与MV共培养的类器官肿瘤细胞中提取RNA进行测序，并进行或不进行阿帕替尼治疗（图6a）。单独培养的类器官和与MV共培养的类器官之间的比较揭示了MV在刺激细胞外基质（ECM）和与迁移相关的途径中的作用（图6b）。VEGFR2抑制剂导致迁移途径改变，但不显著影响ECM组织或有丝分裂（图6c）。这表明MV通过血管生成依赖性和独立性两种方式诱导PDTO的转录变化。
基因集富集分析（GSEA）结果显示，与“组织迁移”和“上皮细胞迁移”相关的途径由单独的MV共培养显著诱导（图6d）。相反，额外的VEGFR2抑制剂处理抑制了这些迁移/迁移相关途径的激活（图6e）。比较由MV显著上调和由VEGFR2抑制剂治疗下调的基因来深入研究血管生成对肿瘤迁移的分子动力学，检索到102个重叠基因（图6f）。KEGG分析将Notch信号传导鉴定为这些基因中最显著富集的途径（图6g）。GSEA进一步证实，MV共培养显著诱导Notch信号传导，而VEGFR2抑制剂处理抑制了该途径（图6hi）。随后对该途径内的基因进行RT-qPCR，同样证实了VEGFR2抑制剂抑制了MV诱导的Notch信号传导（图6j）。因此，研究揭示了MV共培养对PDTO的转录景观和迁移行为的多方面影响，既依赖于血管生成，也不依赖于血管生成（图6k）。总的来说，hTPV芯片是一个有价值的工具，用于评估肿瘤类器官的转移潜力，它们对药物的反应性以及所涉及的复杂分子途径。
图6 通过Notch途径激活由MV诱导的类器官迁移。
结论
本研究开发了一种新的血管类器官系统，具有灌注和分层脉管系统，旨在研究动态肿瘤血管相互作用。该系统包括接近肿瘤类器官的无组织肿瘤诱导的血管生成和超出发芽区域的有组织MV网络，从而捕获更生理相关的分层结构。此外，研究结果强调了Notch信号在促进癌细胞向新形成的血管网络迁移中的作用。该平台还能准确地模拟了抗血管生成治疗（如VEGFR 2抑制剂）的临床反应。总的来说，这种血管化的芯片上类器官模型复制了微环境中细胞之间复杂的相互作用，为癌症中的血管生成和转移异质性提供了深入的见解，并有望进行深入的肿瘤-血管相互作用研究，个性化评估和临床前药物筛选。通过结合现代细胞转录组测序和遗传修饰技术，该平台可以进一步发展为一种新的疾病建模系统，用于研究肿瘤血管生成和治疗抗性。
参考文献
Du Y, Wang YR, Bao QY, Xu XX, Xu C, Wang S, Liu Q, Liu F, Zeng YL, Wang YJ, Liu W, Liu Y, Yu SX, Chen YC, Wang C, Zhang W, Gao H, Luo H, Liu B, Jing G, Guo M, Chen FX, Liu YJ. Personalized Vascularized Tumor Organoid-on-a-Chip for Tumor Metastasis and Therapeutic Targeting Assessment. Adv Mater. 2024 Dec 26:e2412815. doi: 10.1002/adma.202412815. Epub ahead of print. PMID: 39726096.
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