促进肿瘤进展！山大齐鲁：胃癌治疗的潜在靶点

摘要：1月29日，山东大学齐鲁医院及山东大学基础医学院研究团队共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“SP-1-activated LINC01016 overexpression promotes gastric cancer i

【导读】长链非编码RNA（lncRNAs）是胃癌（GC）发生发展过程中的关键调控因子，并可能成为潜在治疗靶点。

1月29日，山东大学齐鲁医院及山东大学基础医学院研究团队共同在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“SP-1-activated LINC01016 overexpression promotes gastric cancer invasion and metastasis through inhibiting EIF4A3-mediated MMP9 mRNA decay”，本研究表明，长链基因间非编码RNA 01016（LINC01016）在伴有淋巴结转移（LNM）的胃癌（GC）组织中的表达量显著高于无LNM组织。LINC01016过表达预示患者更差的无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）。机制研究发现，LINC01016受转录因子SP-1激活调控，可显著增强肿瘤细胞迁移能力。通过RNA pull-down实验联合质谱分析与蛋白质免疫印迹实验验证，确定真核翻译起始因子4A3（EIF4A3）为LINC01016的结合蛋白。LINC01016通过阻断EIF4A3与MMP9 mRNA的结合，抑制EIF4A3介导的无义介导mRNA降解（NMD）作用，从而提升MMP9 mRNA稳定性及蛋白表达水平，最终促进肿瘤进展。LINC01016及其调控的EIF4A3/MMP9信号轴或可成为GC患者的潜在治疗靶点。

https://www.nature.com/articles/s41419-024-07250-z#Sec34

胃癌（Gastric cancer, GC）2022年全球新发病例超96.8万例，死亡病例约66万例，使其成为全球第五大常见新发癌症及第四大癌症致死原因。东亚地区年增长率尤为显著，低收入国家增幅更为突出。胃癌患者多确诊于晚期阶段，以恶性增殖、广泛侵袭、淋巴结转移及耐药性为特征，普遍伴随高死亡率。因此，解析胃癌发生发展机制，将有助于发现新型诊断标志物并开发治疗新策略。

长链非编码RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）是一类新发现的长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子，被证实具有关键调控作用，参与包括胃癌（gastric cancer, GC）在内的多种肿瘤发生发展过程。lncRNAs通过染色质互作、转录调控、介导蛋白-DNA相互作用及表观遗传修饰等多种机制参与肿瘤生物学进程。另有研究表明，促癌lncRNA UCA1通过抑制抗肿瘤miRNA miR-26a的表达，促进GC细胞增殖迁移并抑制细胞凋亡。因此，鉴定胃癌进展中的关键lncRNAs对阐明其发病机制具有重要意义。本研究基于高通量测序数据发现LINC01016在GC组织中异常表达，但其在胃癌转移中的作用机制尚待阐明。

转录因子SP-1通过激活LINC01016转录促进胃癌细胞迁移侵袭

新近研究表明，转录因子（transcription factors, TFs）对多种长链非编码RNA（lncRNAs）的转录调控具有决定性作用。为探究LINC01016过表达机制，本研究通过UCSC基因组数据库预测其转录因子潜在结合位点，构建系列截短质粒进行功能验证。研究人员根据实验推断，LINC01016核心启动子区域包含两个功能结构域。然后，研究人员使用JASPAR算法分析了LINC01016的候选转录调控因子，在转录因子结合区域中确定了LINC01016的上游调控机制。筛选出九个分子作为潜在的转录因子。然而，在荧光素酶和qRT-PCR实验中，只有SP-1能够通过提高荧光素酶活性来增强LINC01016的表达。根据网站的分析，SP-1有四个可能的结合区域，主要集中在−434到−43 bp之间。为了进一步确认SP-1与LINC01016启动子之间的直接相互作用，研究人员构建了过表达SP-1的缺失突变体（P5-Mut），结果显示P5-Mut组的荧光素酶活性比P5野生型组降低了70%。

LINC01016增强了胃癌（GC）的迁移和侵袭能力

研究人员通过将PCDNA3.1-LINC01016和ASO（反义寡核苷酸）转染到胃癌（GC）细胞中，分别过表达和敲低LINC01016的表达，以阐明LINC01016在GC细胞中失调的影响。研究人员通过qRT-PCR检测了过表达和敲低的效率。在测试的三种ASO构建体中，只有si-LINC01016-3成功地将LINC01016的表达降低了70%以上，因此该构建体被用于后续的功能研究。迁移实验结果显示，当LINC01016过表达时，GC细胞的侵袭和迁移能力显著增强；而敲低LINC01016则产生了相反的效果。

此外，研究人员还进行了增殖实验以确定LINC01016的影响，包括集落形成实验、EDU实验和MTS实验。然而，结果表明，无论是过表达还是敲低LINC01016，对胃癌（GC）细胞的增殖均没有显著影响。流式细胞术实验进一步显示，LINC01016对细胞凋亡或细胞周期分布也没有明显影响。

为了确定SP-1对胃癌（GC）细胞生物学行为的影响是否与LINC01016一致，研究人员在HGC27细胞和BGC823细胞中瞬时转染了pEnter和pEnter-SP-1。迁移实验结果表明，过表达SP-1能够增强胃癌细胞系的迁移和侵袭能力。为了证明SP-1通过上调LINC01016促进胃癌细胞的迁移和侵袭，研究人员进行了逆转实验。结果显示，与对照组相比，同时过表达SP-1并敲低LINC01016并未导致细胞迁移和侵袭的显著变化。然而，敲低SP-1同时过表达LINC01016则显著增强了细胞的迁移和侵袭能力。这些发现表明，SP-1可能通过上调LINC01016来促进胃癌细胞的迁移和侵袭。

LINC01016可能是胃癌（GC）潜在治疗靶点

为了阐明LINC01016是否在体内影响肿瘤生长和转移，研究人员将稳定敲低LINC01016的HGC27细胞注射到雄性裸鼠的皮下和尾静脉中，构建了异种移植肿瘤模型。通过qRT-PCR检测了LINC01016的敲低效率。八周后，处死裸鼠。尽管在第五周后，LV-NC组（阴性对照组）的肿瘤体积略大于LV-shLINC01016组（LINC01016敲低组），但两组之间的肿瘤质量没有显著差异。研究人员还观察到，LV-shLINC01016组的皮下异种移植肿瘤表现为非侵袭性或良好包膜化，而LV-NC组的肿瘤则局部侵袭到肌肉组织中。通过血行转移模型，体内成像显示，LV-shLINC01016组的肺转移病灶少于LV-NC组。H&E染色也得出了相同的结论。这些结果强烈表明，LINC01016在增强胃癌细胞侵袭和转移中发挥了重要作用。

LINC01016可能是胃癌（GC）的潜在治疗靶点

最后，研究人员探讨了敲低LINC01016对异种移植肿瘤中MMP9 mRNA和蛋白表达的影响。结果显示，与LV-NC组（阴性对照组）相比，LV-shLINC01016组（LINC01016敲低组）中MMP9的mRNA和蛋白水平显著降低。MMP9的免疫组化结果显示，LV-shLINC01016组中胃癌细胞的染色强度弱于LV-NC组。LINC01016通过阻断EIF4A3与MMP9 mRNA的结合，抑制了EIF4A3介导的无义介导的mRNA降解（NMD），从而导致MMP9 mRNA和蛋白表达增加，促进肿瘤进展。LINC01016或LINC01016介导的EIF4A3/MMP9通路可能是胃癌患者治疗的可行靶点。

【参考资料】

https://www.nature.com/articles/s41419-024-07250-z#Sec34

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