共聚焦显微镜应用案例分享:内质网-线粒体钙转运研究(下)

360影视 日韩动漫 2025-03-14 13:48 3

摘要:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,约占所有女性新发癌症病例的30%,死亡率极高。因此,更好地了解乳腺癌的发病机制对于制定有效的治疗策略至关重要。线粒体的形态和功能被认为与基质硬化驱动的肿瘤进展密切相关,但人们对细胞外基质(ECM)刚度如何影响线粒体动力学和线粒

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,约占所有女性新发癌症病例的30%,死亡率极高。因此,更好地了解乳腺癌的发病机制对于制定有效的治疗策略至关重要。线粒体的形态和功能被认为与基质硬化驱动的肿瘤进展密切相关,但人们对细胞外基质(ECM)刚度如何影响线粒体动力学和线粒体吞噬仍知之甚少。本文作者揭示了一种新的机制,即ER-MITO钙转运通过Drp1(动力蛋白相关蛋白1)易位响应软底物,调节线粒体动力学和线粒体吞噬。这些发现为ECM硬度作为抗肿瘤治疗的潜在靶点提供了有价值的见解。

在本研究中,研究人员使用不同刚度的PAA凝胶基底来模拟乳腺癌的不同进展阶段玻璃基团作为对照。利用MitoTracker Red探针对细胞内线粒体进行染色,以评估基质刚度对线粒体形态的影响,结果显示软基质中的线粒体碎裂增加(图5A-B)。为了验证该裂变是否与Drp1相关,研究人员进行了共定位实验,结果显示软底物诱导更多的细胞在线粒体上招募内源性Drp1,促进线粒体碎裂(图5C)。

图1 软底物诱导MDA-MB-231细胞线粒体分裂。(A)MDA-MB-231细胞线粒体形态的代表性显微照片。线粒体用线粒体追踪器红色(红色)染色,细胞核用DAPI(蓝色)观察。(B)柱状图显示了线粒体平均长度(顶部)、线粒体数量(中间)和线粒体分为碎片、中间和细长形状的百分比的量化。(C)用抗drp1抗体(绿色)、丝裂追踪器红色(红色)和DAPI(蓝色)染色的细胞的代表性图像(D)线粒体裂变和融合蛋白(Drp1、磷酸化的Drp1-s1616和Mfn2)的免疫印迹分析。(E)蛋白表达的定量分析(n = 3)。

接下来研究人员研究了基质刚度对线粒体吞噬的影响。在不同硬度的基底上培养MDA-MB-231细胞,其共聚焦图像显示于玻璃基团上的低表达相比,LC3(细胞自噬标记物)在软底物上高表达并呈点状分布(图2A)。Parkin(线粒体吞噬的经典途径)与线粒体明显的共定位(图2B)表明软底物促进了MDA-MB-231细胞的线粒体吞噬。

图2 软底物促进了MDA-MB-231细胞中的线粒体吞噬。(A)在不同硬度的基底上培养的MDA-MB-231细胞的代表性共聚焦图像(左)。细胞用抗lc3抗体(绿色)、丝裂体追踪器红色(红色)和DAPI(蓝色)染色。虚线中线粒体和LC3的径向荧光强度曲线(右)。(B)GFP-Parkin转染后的Parkin(绿色)和线粒体(红色)的代表性图像。(C)对线粒体或细胞质部分的Parkin和PINK1的免疫印迹分析。(D)蛋白表达的定量分析(n = 3)。

由于钙稳态与内质网应激和线粒体损伤相关,研究人员试图确定钙稳态在软底物诱导的线粒体动力学改变和线粒体吞噬中的作用。通过共聚焦显微镜观察到,钙指示剂Cal520-AM在软基质上标记的细胞质游离钙的含量是玻璃基团的2倍以上(图3A)。这表明软底物触发了钙信号的激活。

图3 软底物增加了Ca2+的浓度和振荡。(A)在不同硬度的基质上培养的MDA-MB-231细胞中胞质钙的代表性图像(左)和相应的平均荧光强度的定量图像(右,n = 3)。

线粒体钙超载是调节线粒体形态和功能改变的关键。研究人员进一步使用荧光Ca2+指示剂Rhod-2 AM标记线粒体钙,该指标显示软底物上的线粒体钙水平显著增加(图4A)。为了观察单细胞中的钙动力学,细胞分别转染了Mito-Gcamp6或ER-Gcamp6质粒。如图8B和C所示,共聚焦成像显示线粒体钙浓度增加,内质网钙浓度降低,提示软底物促进线粒体钙摄取和内质网钙释放。IP3R是激活ER-MITO钙转运通道的关键蛋白。如图4D和E所示,在软底细胞中,线粒体中的IP3R表达量显著增加。以上结果可以初步证明软底物促进ER-MITO接触和激活钙转运通道的运输。

图4 软底物增强了内质网对线粒体Ca2+的摄取。(A)在不同硬度的基质上培养的MDA-MB-231细胞中线粒体钙的代表性共聚焦图像(左)和相应的平均荧光强度的定量。(B和C)转染Mito-Gcamp6或ER-Gcamp6 24小时的细胞中线粒体和内质网钙的代表性显微照片(左)和相应的平均荧光强度的定量。底部的面板显示了盒子区域的放大倍数。比例尺= 10 μm。(D)免疫blot分析线粒体或细胞质组分中的IP3R。(E)用ImageJ软件进行定量(n = 3)。

为了进一步探究内质网-线粒体钙转运信号和线粒体动力学之间的相关性,研究人员利用2APB(2-氨基乙基二苯硼酸酯)检测线粒体裂变和融合相关蛋白的表达水平,以阻断ER-MITO之间的钙转运。免疫荧光结果显示,2APB处理后,软基底上的细胞内Drp1与线粒体的共定位减少,破碎型线粒体部分恢复为伸长型线粒体,且线粒体数量和长度有所增加(图5B-C)。此外,2APB处理明显减弱了软基底介导的Parkin在线粒体膜处的聚集,且部分逆转了PINK1和Parkin的线粒体积累(图5D-F)。以上结果表明,软基底介导的内质网-线粒体钙转运存在线粒体动力学变化的上游,促进Drp1介导的线粒体分裂和自噬。

图5 ER-Mito钙转运介导线粒体裂变和线粒体吞噬。MDA-MB-231细胞在软(10 kPa)或玻璃基底物上培养,没有或存在2APB(50 μM)。线粒体裂变和融合蛋白(Drp1、磷酸化的Drp1-Ser616和Mfn2)的(A)蛋白印迹分析(左)和蛋白表达的定量分析(右)(n=3)。(B)用抗drp1抗体(绿色)、丝裂追踪器红色(红色)和DAPI(蓝色)染色的细胞的代表性显微照片。右边的放大图像显示了Drp1和线粒体共定位的细节。比例尺= 10 μm。(C)柱状图显示了平均线粒体长度(顶部)、线粒体数量(中间)和线粒体百分比,分为碎片、中间和细长形状(D)GFP-Parkin转染后的Parkin(绿色)和线粒体(红色)的代表性图像。比例尺= 10 μm。(E)Parkin和PINK1的Western blot分析。(F)蛋白表达的定量分析(n = 3)。

本研究揭示了力学刺激调控线粒体动力学的分子机制,有助于了解乳腺癌进展过程中钙稳态对线粒体动力学和线粒体自噬的影响,为靶向基质刚度的乳腺癌治疗提供参考信息和潜在的分子靶标。

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来源:凯视迈精密测量

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