2024骨与软组织肿瘤基础研究进展

摘要：骨与软组织肿瘤包括起源于骨骼系统和软组织的各种原发性肿瘤，临床表现多样，具有较高的异质性[1]。其中，常见的骨肿瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤、脊索瘤、骨淋巴瘤、转移瘤等；常见的软组织肿瘤包括滑膜肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤等[2]。

作者：陈成龙刘巍峰

单位：北京积水潭医院骨肿瘤科

骨与软组织肿瘤包括起源于骨骼系统和软组织的各种原发性肿瘤，临床表现多样，具有较高的异质性[1]。其中，常见的骨肿瘤包括骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、多发性骨髓瘤、脊索瘤、骨淋巴瘤、转移瘤等；常见的软组织肿瘤包括滑膜肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤等[2]。虽然骨与软组织肿瘤在整体肿瘤发病率中占比相对较小，但由于其对患者生理功能和生活质量的严重影响，以及其治疗方案的复杂性，其早期诊断和治疗仍然是临床的重大挑战。

近年来，随着分子生物学、基因组学以及免疫学的不断发展，基础研究在骨与软组织肿瘤的病理机制、早期诊断、靶向治疗等方面取得了显著进展。特别是在肿瘤微环境、细胞信号通路、免疫逃逸机制等方面，研究者们取得了一系列的突破性发现。与此同时，新型实验模型、单细胞测序技术、新型抗肿瘤材料和人工智能在肿瘤研究中的应用，也为骨与软组织肿瘤的早期诊断和精准治疗提供了新的研究方向。本文旨在回顾总结2024年度骨与软组织肿瘤基础研究领域的最新进展，重点关注肿瘤的分子病理机制、关键的信号通路、免疫微环境对肿瘤进展的影响、靶向治疗策略的研究进展，以及骨与软组织肿瘤的早期诊断技术等。

笔者在Web of science和Pubmed数据库中使用Musculoskeletal tumor /oncology, Orthopedic oncology, chordoma, Bone Tumor, Soft-tissue Sarcoma, Osteosarcoma, Chondrosarcoma, Ewing Sarcoma, Giant Cell Tumor of Bone等相关词对2024年发表文献进行检索，剔除临床研究、个案报道及综述类文献，最终检索到7784篇基础研究类文献。对上述检索结果进行分析，发现主要研究类型集中在分子生物学、药理学、细胞生物学、免疫学、基因和遗传学（图1），其中发文最多的国家依次为中国3310（42.5%）篇，美国1261（16.2%）篇，日本362（5%）篇（图2）。

图1 2024年基础研究主要关注方向

图2 不同国家2024年基础研究发文量

进一步对文献中的关键词进行共现分析（VOS viewer 1.6.20 software)，研究最多的肿瘤依然是骨肉瘤，各类肿瘤的研究热点集中在细胞信号转导、肿瘤微环境、基因表达调控、凋亡、巨噬细胞、间充质干细胞、免疫治疗和活性氧等（图3）。相较于过往的基础研究，近些年的研究更加强调了肿瘤细胞作为整个环境中的一部分，与其他免疫细胞及细胞外基质等相互作用的重要性，同时结合了更多如新型材料等应用的交叉研究。

图3 2024年研究热点分布

2.1 Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin信号通路是一个在多种生理和病理过程中起着至关重要作用的信号通路，主要涉及细胞的增殖、分化、存活及迁移等生物学过程，并且与各种实体瘤中的癌症干细胞自我更新过程有关[3]。其主要机制为Wnt蛋白通过与细胞膜上的Frizzled受体结合，激活胞内β-catenin的积累，进而影响细胞的转录活动（图4），在骨代谢、癌症发生以及其他多种疾病中起着至关重要的作用。

近期，Deng等[4]研究者发现，吡咯啉-5'-磷酸氧化酶在多（pyridoxine-5’-phosphate oxidase, PNPO）发性骨髓瘤（Multiple myeloma, MM）细胞的增殖与转化中起着关键作用；研究表明，PNPO通过氧化disheveled 3 (DVL3)的M282位点，促进其与GSK3β的结合，防止β-catenin被蛋白酶体降解。这一过程导致β-catenin在细胞内积累，并促进了MYC等基因的上调，进而加速MM细胞的增殖和骨质破坏过程。艾曲波帕（Eltrombopag）是一种非肽类的血小板生成素受体（TpoR）激动剂，该研究表明，Eltrombopag能够通过与PNPO结合，抑制PNPO与DVL3的相互作用，从而抑制Wnt/β-catenin通路的过度激活；提示了Eltrombopag未来作为MM及其他Wnt/β-catenin信号通路异常激活肿瘤的治疗前景。

在骨肉瘤中，关于Wnt/β-catenin信号通路激活程度的研究存在一定差异，目前尚未明确揭示其因果关系。部分研究基于对Wnt配体、LRP5/6共受体以及细胞质中β-catenin的染色分析，提出骨肉瘤细胞可能通过自分泌机制介导Wnt/β-catenin信号的异常激活。

研究还表明，骨肉瘤的转移性表型与β-catenin水平升高密切相关，例如，β-catenin的升高可能绕过Wnt抑制，从而维持细胞的侵袭性表型。Zhang等[5]人在近期的研究中发现，细胞生长调节蛋白CGREF1 (cell growth regulator with EF-hand domain 1)通过调控Wnt通路中的GSK3β/β-catenin信号，增强Cyclin D的表达，从而促进骨肉瘤细胞从G1/G0期向S期的过渡，并促进其增殖；提示靶向CGREF1有望成为未来治疗骨肉瘤的新手段。

值得注意的是，由于β-catenin与骨代谢及其调节密切相关，研究表明，骨和成纤维细胞来源的Dickkopf-1（DKK1,Wnt/β-catenin抑制剂）能够促进局部肿瘤微环境和全身DKK1水平的增高，进而抑制NK细胞的对肿瘤的细胞毒性，并促进乳腺癌的骨转移[6]。无独有偶，Goldstein等人在骨肉瘤荷瘤小鼠血液中检测并发现DKK-1水平与肿瘤增殖之间存在相关性，用抗DKK-1的单克隆抗体BHQ880治疗，可以减缓PDX异种骨肉瘤原位移植瘤的生长和转移。进一步证实了利用DKK1作为靶点治疗骨肉瘤及骨肿瘤转移的可行性[7]。

Ryota Shirai等研究者在2024年证明了尤文氏肉瘤细胞中β-catenin的表达依赖于CDH11的表达，且Wnt/β-Catenin通路的强大激活部分依赖于CDH11。CDH11的缺失可导致转移性较低的表型，即肿瘤微环境中对Wnt配体的反应较低。CDH11在尤文肉瘤细胞中是主要表达的粘连蛋白，CDH11-β-catenin复合物在细胞膜和细胞质上高度表达，CDH11的缺失会导致β-catenin不稳定，并降低对Wnt配体的反应[8]。该研究证明了CDH11在尤文肉瘤中不仅是一种粘附分子，而且还是Wnt配体反应性的关键调节因子，而Wnt配体反应性是导致尤文肉瘤上皮间质转化（EMT）和转移进展的关键因素。靶向CDH11进而抑制Wnt/β-Catenin通路的激活在尤文肉瘤的治疗中同样具有不可估量的应用前景。

图4 Wnt/β-catenin通路调控的关键步骤[3]；LRP（低密度脂蛋白受体相关蛋白），GSK-3β（糖原合成酶激酶3β），CKIα（Casein激酶1α），APC（腺瘤性息肉病），TCF/LEF（T细胞特异性转录因子/淋巴增强因子）

2.2 Notch通路

包括骨肉瘤在内的众多恶性肿瘤的特征即丰富的血管生成和肿瘤干细胞（CSCs）的自我更新，Notch信号在这两类肿瘤特征中发挥了极其重要的调控作用，同时，Notch的表达与p53缺失的协同作用被发现与促进骨肉瘤的发展密切相关[9]。肿瘤血管生成始于内皮细胞（ECs）对局部刺激做出反应并向增殖的肿瘤细胞进行迁移，从而形成由血管周围支持细胞包围的管状结构，将血液输送到肿瘤内部。而新生血管支持肿瘤的发展和侵袭转移，这一过程受到包括Notch等多种信号通路的高度调控。Notch通路由五种配体（Jagged1、Jagged2和Delta-like 1、3和4）和四种受体（Notch 1-4）组成，其蛋白受体以非共价连接的异二聚体形式存在于细胞表面，由细胞外和跨膜（细胞内）Notch多肽组成[10]。

在生理性血管生成过程中，VEGF通过作用于其受体VEGFR-2促进内皮细胞生成，并通过协调迁移、增殖和分化过程产生新的血管。新生的“尖端”细胞通过VEGF信号传导诱导DLL4的表达，进而激活相邻内皮细胞中的Notch-1，而Notch-1负反馈抑制VEGFR2和VEGFR3的表达，防止了血管内皮细胞的过度生成。在肿瘤中，肿瘤细胞绕过DLL4激活通路，通过表达的Jagged-1介导Notch激活，抑制可溶性VEGFR1的表达（sVEGFR1；也称为可溶性FLT1）。这种可溶性受体充当诱饵，将VEGF困在细胞外，阻断DLL4导致过度发芽和血管生成紊乱，促进肿瘤周围的异常血管生成。

与此同时，Notch信号通路同样在骨肉瘤的旁分泌和微环境相关信号中参与了CSCs的调控。最近，Zhuo等人报道白细胞介素-24通过同时下调Notch和Wnt/β-Catenin信号通路，抑制CD133+细胞的表达及骨肉瘤CSCs的表型和致瘤性[11]。此外，U2OS和143B细胞与人脐静脉内皮细胞来源的外泌体共培养可增强CSCs标志物POU5F1和SOX2的表达，并增加STRO-1+/CD117+细胞的比例；上述作用与Notch1、Hes1和Hey1的上调成正相关，并可被γ-分泌酶抑制剂逆转[12]。

然而Notch蛋白在上述的作用有可能因不同的调控条件发生改变，例如，当细胞上的Notch跨膜配体（如DLL1/3/4和Jagged1/2）与来自另一个细胞的跨膜受体（如Notch1-4）相互作用时，会引发蛋白水解级联反应并释放细胞内片段，该片段可与CSL转录因子相互作用，控制靶基因（如P21、CYCLIND1、CMYC以及HES和HEY家族基因）的表达，在这一信号级联过程中，活性Notch细胞内结构域（NICD）被γ-分泌酶裂解。这个过程中Notch若参与干细胞自我更新的调节时，会产生癌基因的作用，如果它参与细胞终端分化的调节，就会成为肿瘤的抑制因子。因此，在未来Notch调节肿瘤发生和进展的研究中，其对肿瘤的调控作用需要被更深入地探讨。

2.3 PI3K/Akt/mTOR通路

PI3K/Akt/mTOR通路是由三大主要组分构成：PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）、Akt（蛋白激酶B）和mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）。该通路从细胞外信号传递到细胞内，调控细胞的生长、增殖、存活、代谢以及迁移等重要生物学过程。

其中，PI3K是一个由调节亚基和催化亚基组成的酶，其主要作用是生成PIP3，从而激活下游的Akt；而PI3K的激活通常由细胞表面的受体（如生长因子受体）引起[1]。Akt是PI3K通路的核心效应分子之一，Akt在膜上被PIP3激活后，会进一步磷酸化多个靶标，包括参与细胞周期调控、细胞存活、蛋白合成等过程的关键蛋白。mTOR是一个大分子复合体，分为mTORC1和mTORC2，其中mTORC1主要调节细胞生长和代谢，而mTORC2主要调控细胞存活和形态，mTORC1的激活依赖于PI3K/Akt信号，促进蛋白质合成和细胞生长。

Huang等人[13]近期的研究发现，SLC38A5能够通过谷氨酰胺介导的PI3K/AKT/mTOR信号通路促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，抑制铁死亡，通过靶向SLC38A5和PI3K/AKT信号通路能够激活铁死亡进程并产生活性氧，抑制骨肿瘤细胞的进展。在对安罗替尼耐药的骨肉瘤细胞中，Chen等人[1]发现其PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活，与非耐药的骨肉瘤细胞相比PTEN表达缺失，应用PI3K抑制剂能够抑制该通路的异常表达并迫使PIP3向PIP2进行转化，进而抑制mTORC2调控的下游Akt通路，增强安罗替尼对VEGFR-2的抑制作用，逆转其耐药进程。近期有学者开发了一种基于H2O2响应的十二烷酸-苯硼酸酯-葡聚糖聚合胶，用于稳定负载疏水性的选择性PI3K/mTOR抑制剂GNE‑477并抑制骨肉瘤的生长[14]。通过PI3K/AKT/mTOR通路的持续信号异常传导是恶性神经鞘肿瘤的主要驱动因素。然而，单靶向这一途径并不足以抑制明显的生长。

Schulte等人[15]利用泛Akt抑制剂MK-2206和mTORC1/mTORC2抑制剂AZD8055分别进行治疗研究时，发现两种药物在恶性神经鞘肿瘤的治疗中具有一定的效果。然而，当使用AKT/mTOR联合方案进行体内实验时，未观察到对肿瘤生长明显的抑制作用。通过进一步分析对AKT/mTOR治疗无效的异种移植肿瘤，发现在几个肿瘤样本中AKT和mTOR都被重新激活，表明在体内的耐药与该通路相关。与AKT/mTOR双抑制相比，在体外细胞利用MEK1/2抑制剂AZD6244对RAS/RAF/MEK/MAPK通路的额外靶向对恶性神经鞘肿瘤细胞系的活力有协同抑制作用。表明AKT和mTOR抑制剂联合治疗在体外对恶性神经鞘肿瘤细胞有效，但在体内可通过恢复AKT/mTOR信号传导迅速产生肿瘤耐药，表明AKT、mTORC1/2和MEK1/2抑制剂的三联治疗可能是一种更加有效的治疗方案。

Palombo等人[16]研究表明，ATF3是Ewing肉瘤细胞中PI3K/AKT/mTOR通路的重要介质，ATF3通过调节包括CXCL8在内的几个趋化因子编码基因发挥其促肿瘤活性，ATF3/IL-8轴能够促进M2表型影响巨噬细胞浸润周围肿瘤微环境。通过ATF3-CXCL8轴抑制PI3K/AKT/mTOR通路能够促进M2型巨噬细胞向M1型诱导转化，减缓Ewing肉瘤的进展和侵袭（图5）。

在未来，更多通过PI3K/AKT/mTOR信号通路研制的抑制剂如Idelalisib，Copanlisib和Everolimus等会应用到骨与软组织肿瘤的基础和临床试验中，同时，联合使用其他信号通路抑制剂（如MAPK抑制剂、PD-1单抗）也逐渐成为新型的治疗策略。

图5 PI3K/AKT/mTOR通过ATF3/IL-8轴促进M2型巨噬细胞浸润和Ewing肉瘤进展[16]

2.4 Hedgehog通路

Hedgehog（刺猬蛋白）通路是一个依赖于配体-受体相互作用的信号级联，其最终导致GLI转录因子的激活，该途径调控着胚胎发育的关键过程，控制细胞的分化、增殖和干细胞的自我更新[17]。该通路主要由Hedgehog配体、受体Patched1（PTCH1）、共受体Smoothened（SMO）、转录因子Gli家族成员（GLI1、GLI2、GLI3）等组成。

在Hh信号通路的经典机制中，未受刺激时，PTCH1抑制SMO的活性。当Hh配体与PTCH1结合时，PTCH1的抑制作用解除，SMO被激活，进一步传递信号至GLI转录因子。激活的GLI转录因子进入细胞核，调控下游靶基因的表达，从而影响细胞增殖、分化和凋亡。在肿瘤的异常调节中，Hedgehog通路参与旁分泌信号、基质和肿瘤细胞之间的相互作用以及CSCs中的通路激活介导的耐药等进程。

Wang等人的研究发现，异常激活的Hedgehog信号通路促进了软骨肉瘤的发生和进展，阻断Hedgehog通路远端转录因子GLI1是治疗软骨肉瘤的有效策略[18]。该研究发现了GLI1与MVP/mTOR/S6K1通路的作用关系，从而为GLI1和MVP作为治疗软骨肉瘤的联合靶点提供了理论依据。

类似地，在近期的研究中，Banday等人[19]使用CRISPR/Cas9筛选，发现C1GALT1是促进Ewing肉瘤细胞中EWSR1::FLI1表达的因子。实验结果表明，C1GALT1、Hedgehog信号和EWSR1::FLI1表达之间的关系模型如（图6）所示。在胚胎干细胞中，高水平的C1GALT1通过SMO的o-糖基化以非规范（即与配体无关）的方式刺激Hedgehog信号通路，从而阻断SMO的蛋白酶体/溶酶体降解并使其稳定。使用抗真菌药伊曲康唑对C1GALT1进行抑制，可降低人Ewing肉瘤细胞系中EWSR1::FLI1的表达，导致细胞死亡，并抑制Ewing肉瘤小鼠模型肿瘤的生长。

同样，在骨肉瘤中，通过Hedgehog信号通路调控肿瘤发生和发展依然是近些年的研究热点。Giliberti等人[20]研究表明，姜黄素（Curcumin）与甲氨蝶呤联合使用能够靶向Hedgehog信号通路中的关键步骤（如PTCH1、SMO、GLI1和GLI2），促进骨肉瘤细胞凋亡及抑制其NF-kB和基质金属蛋白酶（MMP-2/MMP-9）的表达，进而降低了骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力。

同时，越来越多的研究表明Hedgehog信号通路能够与其他通路相互作用并增强骨肉瘤的侵袭力，如Hedgehog-Gli1信号通路通过对GSK3-β的失活作用，调控对去半乳糖促肽素的抑制反应，导致肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移抑制作用的逆转[21]。而Hedgehog信号通路的激活，能够在间充质干细胞中协同Wnt/β-Catenin通路，诱导软骨肿瘤和骨肿瘤的形成[22]。在骨巨细胞的研究中极少提到Hedgehog信号通路，然而同样有研究发现，存在于骨巨细胞瘤的肿瘤间质细胞中的初级纤毛（基于微管的细胞器）生成与Hedgehog信号通路的激活相关，这可能参与了骨巨细胞瘤细胞局部侵袭作用及多种细胞基质间的相互调节[23]。

图6 C1GALT1介导的Hedgehog信号和EWSR1::-FLI1表达调控模型[19]

肿瘤微环境（Tumor microenvironment, TME）以免疫细胞网络的形式存在，它的功能多样、复杂，并通过劫持关键的生理途径来促进肿瘤的生长，由肿瘤细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质以及细胞间信号通路等多种因素共同构成。在骨与软组织肿瘤中，免疫微环境的特点较为特殊。骨肉瘤和软组织肉瘤的免疫微环境往往表现出免疫耐受性和免疫抑制状态，部分肿瘤表现为低免疫细胞浸润，且T细胞功能受到抑制。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）在这些肿瘤的免疫逃逸和肿瘤转移中起着关键作用，此外，调节性T细胞（Tregs）、骨髓来源抑制细胞（MDSCs）等，也常常导致免疫逃逸，削弱免疫系统对肿瘤的攻击。TME的抑制作用也可能部分来源于肿瘤细胞分泌的外泌体，它们可以驱动各类细胞创造有利于肿瘤细胞归巢的微环境。

近年来，许多研究证实肿瘤源性外泌体可以产生免疫抑制，这类外泌体可以通过多种途径抑制T细胞和NK细胞的活性，甚至诱导T细胞凋亡，同时刺激骨髓源性抑制细胞活性，从而支持肿瘤细胞逃避免疫监视。骨肉瘤源性外泌体释放可溶性主要组织相容性复合体I链相关蛋白（sMIC）和NKG2D可溶性受体可介导NK细胞或细胞毒性T细胞的下调，从而为骨肉瘤细胞进行免疫逃逸提供了有利的环境和条件[24]。

Wang等人证实外泌体来源的PD-L1表达在有肺转移的骨肉瘤患者中高表达，骨肉瘤细胞能够通过释放富含PD-L1的外泌体促进肺转移，检测血清外泌体PD-L1表达可预测骨肉瘤患者肺转移进展[25]。

有研究表明，癌症相关成纤维细胞通过分泌生长因子，最终为肿瘤生长创造理想的TME。转化生长因子-β（TGF-β）在骨肉瘤患者中（尤其是转移性肿瘤）表达高于健康个体，能够在TME中刺激肿瘤生长并产生会化疗的抵抗反应。TGF-β抗体与树突细胞联合可增强骨肉瘤患者的全身免疫应答，产生抗肿瘤作用。此外，TAMs在免疫反应中起着至关重要的作用，研究报道，M2型TAM与众多肿瘤患者转移和生存率降低有关，Zhou等人报道全反式维甲酸可通过抑制TAM的M2极化抑制骨肉瘤细胞肺转移[26]。而肿瘤微环境的抑制与PD-1、IDO、TGF-β、STAT3、VEGF和IL-10等通路的过度激活有关，这些免疫结点或通路对Trges、MDSCs、TAMs等具有免疫抑制作用。因此，近年来有越来越多的研究利用肿瘤内微环境的免疫标志物，直接或间接地改善其免疫微环境，实现综合的免疫治疗效果。

3.1 免疫检查点抑制剂

众多研究已经表明在包括骨肉瘤在内的实体瘤具有丰富的PD-L1表达和I类MHC的缺失，且转移瘤中PD-L1表达高于原发肿瘤[27]。

近期，Kaistha等人[28]联合PD-L1和CD73单抗及细胞毒性药物在纤维肉瘤中验证了结合免疫检查点抑制剂，能够提升肿瘤微环境中CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的浸润比例，并增强化疗药在肿瘤治疗中的效果。

有趣的是，近期Panagi[29]的研究表明，在TME中的肿瘤驻留肥大细胞（Tumor-resident mast cells, MC）能够通过细胞串扰控制癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAF）的活性影响TME，通过靶向MC，例如应用酮替芬等其他抗组胺药，能够增强免疫检查点抑制剂PD-L1单抗在肉瘤中的疗效。

此外，靶向抑制细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）同样抑制了T细胞活化和增殖的负向调控。Takenaka等研究者报道了CTLA-4单抗能够抑制骨肉瘤模型小鼠肿瘤的生长，同时，单次剂量16 Gy或8 Gy×3次的X射线照射可显著增加体外IFN-β的分泌，使放疗后的肿瘤显著消退，并延长与CTLA-4联合治疗后骨肉瘤小鼠的总生存期[30]。而联合两种甚至多种免疫检查点抑制剂，如在骨肉瘤细胞中联合应用CTLA-4、PD-L1和TIM3单抗，被证明相较于单种抑制剂具有更明显的肿瘤抑制作用[31]。

然而虽然这些免疫检查点在骨肉瘤中均呈现较高的蛋白表达[32]，但是临床试验的疗效却相较于血液系统肿瘤或黑色素瘤差，这也与骨肿瘤的“免疫荒漠”（CD8+T细胞匮乏）特点密切相关。相反，骨肉瘤等骨与软组织肿瘤中存在大量巨噬细胞浸润，研究表明巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用常被CD47分子（与巨噬细胞SIRPα结合）抑制。体外和体内骨肉瘤模型实验表明，CD47单克隆抗体可阻断CD47-SIRPα信号通路，从而增强巨噬细胞的抗肿瘤能力[33]。类似地，脊索瘤肿瘤细胞通过分泌CCL5招募和诱导TAMs向M2型极化来促进肿瘤进展（图7），敲减CCL5蛋白表达或应用MVC（CCL5/CCR5抑制剂）能够有效抑制脊索瘤的进展和M2型巨噬细胞的极化[34]。

图7 脊索瘤免疫微环境多重免疫荧光染色及分析[34]

3.2 细胞免疫治疗

细胞免疫治疗是一种通过增强或改变免疫细胞功能来治疗肿瘤的方法，其核心思想是利用或改造患者自身的免疫系统，特别是T细胞、NK细胞等，以识别并杀伤肿瘤细胞。这种方法与传统的放疗和化疗相比具有特异性强、副作用较小等优势。最常见的CAR-T细胞疗法（Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy）是将患者的T细胞提取出来，并通过基因工程技术将其改造，使其表达能够识别肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体（CAR）。这些经过改造的T细胞被重新注入患者体内，帮助免疫系统识别并攻击肿瘤细胞[24]。

Wickman等研究者[35]PCR和免疫组织化学等方法检测了患儿骨肉瘤、横纹肌肉瘤和Ewing肉瘤中编码C域的肿瘤胎儿型蛋白（the oncofetal version of tenascin C encoding the C domain C.TNC）含量，并从人外周血单个核细胞中产生转基因T细胞，生成C.TNC-CAR-T细胞，为提高C.TNC-CAR-T细胞的抗肿瘤活性，Wickman研究团队设计了一种基于亮氨酸拉链的嵌合细胞因子受体，可通过激活IL-18R信号通路（Zip18R）增强其稳定性，最终证实应用C.TNC-CAR-T在IL-18R的促进作用下有效抑制了实体肿瘤的进展。类似地，CXCR2和CXCR6也被发现是增强骨肉瘤中CAR-T对T细胞归巢效应的受体，Talbot及其团队[36]据此构建的CXCR2-和CXCR6-B7-H3.CAR-T能够在143B骨肉瘤细胞系移植瘤、原位移植瘤模型和转移瘤模型中抑制肿瘤的生长（图8）。

图8 CXCR-B7-H3.CAR-T在骨肉瘤异位/原位移植瘤及转移瘤模型中的抗肿瘤效果[36]

此外，基于TILs（Tumor-Infiltrating Lymphocytes）疗法和NK细胞疗法（Natural Killer Cell Therapy）的肿瘤治疗研究也常有报道。TILs疗法是通过从肿瘤组织中分离出浸润的淋巴细胞（主要为T细胞），并在体外进行扩增，然后将这些细胞回输给患者。TILs通常能够有效识别肿瘤细胞并具有较强的抗肿瘤活性。近期的研究发现，IL12修饰后的膜载TILs细胞能够通过促进IFNγ产生及CCKAR的下调，抑制肉瘤组织的胶原蛋白形成，进一步提升了T细胞的肿瘤浸润和该TILs细胞的抗肿瘤效果[37]。而NK细胞疗法则无需事先通过抗原呈递来激活，它们能通过识别肿瘤细胞上的“压力信号”而直接发挥作用[24]。由于T细胞肿瘤浸润不良、免疫抑制肿瘤微环境和脱靶效应等问题，CAR-T细胞在治疗实体肿瘤方面面临着巨大的挑战；相较于CAR-T疗法，CAR-NK细胞的应用可能更适合与骨肿瘤治疗。近期的研究中，一种靶向ephrin a型受体-2（EphA2）抗原的CAR-NK细胞被证实在小鼠横纹肌肉瘤和骨肉瘤模型中具有良好的抗肿瘤活性[38]。

3.3 肿瘤疫苗

肿瘤疫苗的基本原理是通过引发机体免疫反应，特别是特异性T细胞免疫反应，来识别并消灭肿瘤细胞。肿瘤疫苗可以通过多种途径进行设计和制备，主要包括以下几类。

1.肿瘤抗原疫苗：这类疫苗使用肿瘤特异性或肿瘤相关抗原（TAA）作为免疫原，如MAGE家族抗原、NY-ESO-1、HER2等。

2.细胞免疫疫苗：通过将肿瘤患者的外周血单个核细胞或树突状细胞分离后与肿瘤抗原共同培养，激活T细胞，并将其重新注入患者体内以引发抗肿瘤免疫反应。

3.病毒载体疫苗：利用腺病毒、腺相关等病毒作为载体，携带肿瘤抗原基因并导入机体，以激活宿主的免疫系统。

4.核酸疫苗：包括DNA疫苗和RNA疫苗，利用编码肿瘤抗原的DNA或RNA来刺激机体的免疫系统。

有研究发现，利用骨肉瘤K7M3细胞系裂解物为刺激源制备CD103+的树突细胞（DC）疫苗，能够诱导骨肉瘤模型小鼠的全身免疫反应，增加了肿瘤和淋巴结中T细胞的浸润比例，对骨肉瘤及其肺转移瘤有着显著的抑制作用；同时，对已建立的肺转移模型联合CTLA-4治疗，能够提高该肿瘤疫苗在骨肉瘤中的治疗效果[39]。

Delta-24-ACT是一种溶瘤腺病毒，经修饰可表达免疫共刺激配体4-1BB（4-1BBL）。当这种配体在病毒感染的细胞上表达时，可与T细胞相互作用促进活化T细胞的生存和扩增，改善局部骨肉瘤的靶向性，增强全身免疫反应[40]。在骨肉瘤细胞系中，Delta-24-ACT能够杀伤肿瘤细胞并引发损伤相关分子模式（DAMPs）的产生，在骨肉瘤小鼠模型中，Delta-24-ACT对原发肿瘤和转移瘤均有抗肿瘤作用，并显著延长生存时间。另一类表达p53的溶瘤腺病毒OBP-702被研究发现可以通过抑制MDR1的表达，提升骨肉瘤对多柔比星的敏感性，在与多柔比星联合应用时，能够逆转骨肉瘤细胞系（U2OS、MNNG和HOS）对其的耐药并提升肿瘤杀伤活性[41]。另一项与之类似的研究表明，p53-激活的溶瘤病毒OBP-702能够通过抑制BCL-xL表达，提高软组织肉瘤的放射敏感性[42]。然而，由于多种细胞成分和变量的参与，使得肿瘤免疫相关的基础研究开展相对复杂，因此未来需要结合更先进的体内外模型建立方法，开展更多的基础和临床试验，探究免疫微环境调控骨与软组织肿瘤的途径和治疗策略。

4.1 DNA甲基化

DNA甲基化是表观遗传学中最为经典的调控方式之一，研究发现，骨软组织肿瘤中存在显著的DNA甲基化变化，这些变化通常导致肿瘤抑制基因的沉默，或是某些原癌基因的激活。例如，在骨肉瘤中，p16INK4a和MGMT等基因经常出现异常的甲基化状态，这种改变可能影响肿瘤的侵袭性和预后。近期有研究发现，赖氨酸甲基转移酶5A抑制剂UNC0379能够通过YBX1/RAC3轴抑制RAC3，最终促进Ewing肉瘤的细胞凋亡和铁死亡[43]。在骨肉瘤的相关研究中，发现CXCR4和CARM1在多柔比星耐药的细胞中过表达，染色质免疫沉淀研究进一步揭示了CARM1受H3R17位点甲基化的调节，进而影响YAP的表达，且CARM1的过表达可以抵消CXCR4抑制后对骨肉瘤生长抑制的影响，提示通过干扰H3R17位点甲基化的调节和CXCR4-CARM1-YAP轴有望逆转骨肉瘤对多柔比星的耐药[44]。

4.2 组蛋白修饰

组蛋白不仅是染色体的结构组成部分，而且在基因表达调控、细胞分裂、DNA修复等过程中起着关键作用。通过乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修饰形式，组蛋白能够影响染色质的构象和基因的表达。研究表明，H3K27me3和H3K9me3等组蛋白修饰在软骨肉瘤中与肿瘤的发生、发展密切相关。此外，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在骨肉瘤中的异常表达也被认为是肿瘤发生的关键因素，研究发现组蛋白去乙酰化酶1和2（HDAC1/2）抑制剂罗米地辛，能够通过抑制NRP1的表达，干扰NRP1与整合素β1（ITGB1）的相互作用最终对肺转移性骨肉瘤起到治疗作用[45]。

近期，通过RNA-seq，ATAC-seq和对接分析等研究发现，组蛋白赖氨酸去甲基化酶（KDM）是融合阳性横纹肌肉瘤（FP-RMS）中PAX3-FOXO1融合癌基因的作用靶点；进一步利用工程细胞系筛选出对KDM3B高度选择性的抑制剂P3FI-90，利用该抑制剂作用后发现可下调PAX3-FOXO1活性，并在体外内抑制FP-RMS的生长[46]。近年来，针对组蛋白乙酰化酶、去乙酰化酶、组蛋白甲基转移酶（HMTs）等酶的抑制剂在临床前研究中显示出潜力。例如，去乙酰化酶抑制剂如Vorinostat、Romidepsin等已被批准用于治疗某些类型的淋巴瘤，而对于骨与软组织肿瘤的治疗研究仍在进行中。

4.3 非编码RNA

非编码RNA根据其长度和功能可分为：

1.长链非编码RNA（lncRNA）：长度超过200个核苷酸，参与基因表达调控、染色质重塑、细胞周期控制及表观遗传学调控等过程。

2.小RNA：包括微小RNA（miRNA）、小干扰RNA（siRNA）等，通常长度为20-30个核苷酸，主要通过靶向mRNA进行转录后调控。

3.环状RNA（circRNA）：一种特殊形式的RNA，通过3'和5'末端自连接形成环状结构，且能作为miRNA的“海绵”，调节miRNA的功能，进而影响肿瘤的发生发展。

研究发现lncRNA-HOTAIR在骨肉瘤中上调，它通过招募Polycomb Repressive Complex 2（PRC2）抑制相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。另一项研究表明lncRNA-HOTAIR能够通过吸附miR-217并靶向抑制ZEB1的表达促进骨肉瘤的发生发展[47]。又如，lncRNA MALAT1通过调节转录因子并参与剪接过程，影响软组织肉瘤的进展和转移。此外，lncRNA还可以通过影响肿瘤微环境、肿瘤干细胞的自我更新以及与癌基因或抑癌基因的相互作用来促进肿瘤的发生。例如，lncRNA TUG1 在骨肉瘤中的过表达促进了细胞的增殖和迁移，通过与ZBTB7C相互作用调控其功能，影响肿瘤细胞的凋亡[48]。近年来，由于非编码RNA的特点，越来越多的研究者将其作为临床早期诊断检测和预后分析的指标进行研究，期待未来能够有更多精准有效的非编码RNA试剂盒问世，服务于广大肿瘤患者。

5.1 基于CRISPR/Cas9技术的相关研究

CRISPR/Cas9技术自2012年首次问世以来，已成为基因编辑领域的革命性工具，它是一种源自细菌的基因编辑技术，其中CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）为细菌用来抵御病毒侵染的一种免疫机制，而Cas9（CRISPR-associated protein 9）则是一种DNA核酸酶，能够根据预设的RNA序列精准地切割DNA。这种系统的核心优势在于，用户可以通过设计特定的向导RNA（gRNA），引导Cas9蛋白定位到目标基因的特定区域，实现定点切割和基因编辑。该技术它凭借其高效、精准和灵活的特点，迅速在基础研究和临床治疗中获得广泛应用。特别是在肿瘤研究中，CRISPR/Cas9为我们提供了更为精确的基因功能研究手段，推动了肿瘤的机制研究与治疗策略的探索。

Tan等研究者[49]利用CRISPR-Cas9功能基因组学和转录组学等方法，明确了病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白KIAA1429在Ewing肉瘤中扮演者重要的作用。体内外CRISPR-Cas9敲除筛选实验鉴定KIAA1429为Ewing肉瘤依赖基因，抑制KIAA1429可在体内外通过调节核糖体相关细胞周期和癌症相关炎症，以及对STAT3的调控抑制Ewing肉瘤的肿瘤发生。同样地，利用以Nurd为中心CRISPR/Cas9失活筛选鉴定发现解旋酶CHD4对Ewing肉瘤的增殖至关重要，CHD4沉默可诱导肿瘤细胞凋亡，在此基础上与奥拉帕尼联合抑制PARP通路能够进一步抑制肿瘤生长，表明了利用以NuRD亚基CHD4作为Ewing肉瘤的治疗靶点，可以增强基因毒性药物的抗肿瘤活性[50]。

Wang等人[51]使用全激酶CRISPR-Cas9敲除筛选技术，揭示了骨肉瘤细胞存活和生长所必需的polo样激酶1（PLK1）在肿瘤进展中的作用。敲除PLK1后显著抑制体外骨肉瘤细胞的增殖和体内异种骨肉瘤移植物的肿瘤生长，使用PLK1抑制剂Volasertib可以通过DNA损伤引发的细胞周期阻滞和凋亡有效地抑制骨肉瘤的生长。免疫逃逸是骨肿瘤耐药性的重要因素之一，利用CRISPR/Cas9技术可以被用于敲除免疫检查点抑制分子，如PD-1、CTLA-4等，增强免疫系统对肿瘤细胞的识别与清除。通过CRISPR技术敲除已知的肿瘤抑制基因如TP53，可以帮助研究其在肿瘤发展中的作用，此外，CRISPR还可以用于创建肿瘤小鼠模型，以便研究肿瘤的发生和转移过程，并为肿瘤的个体化治疗提供了新的研究方向。然而，基因编辑在临床应用中可能引发伦理和安全性问题，特别是在人体基因编辑层面，如何平衡技术的潜力与伦理考量，依然是一个需要长期探讨的话题。

5.2 液体活检与分子标志物

液体活检作为一种非侵入性检测手段，近年来逐渐成为肿瘤早期筛查的热点。对于骨与软组织肿瘤，液体活检主要通过检测血浆中的循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs），ctRNA和外泌体等分子进行肿瘤的早期筛查。微流控技术和表面增强拉曼光谱（SERS）近年来被多次报道用于肿瘤血浆中外泌体和肿瘤相关标志物的检测和分析。

Han等人[52]利用该方法，分析了20例骨肉瘤患者和20例健康对照的血浆源性外泌体上CD63、vimentin和EpCAM三种蛋白质生物标志物的水平，其敏感性为100%，特异性为90%，准确率为95%。近日，Xu等人利用一种激光诱导的正向转移高活力CTC辅助微滤系统（LIFT-AMFS）对全血中的CTC进行捕获并分离其cDNA（图9），提取获得的cDNA能够满足后续肿瘤鉴定和基因检测等试验[53]。该类液体活检技术不需要复杂的操作和昂贵的设备，作为一种液体活检技术，在癌症的临床诊断中有很大的前景。

图9 基于LIFT-AMFS的CTC富集和检测

近年来，基于各类交叉学科如纳米技术与药物递送、抗肿瘤材料的动力疗法、3D打印技术及AI辅助诊疗的技术被广泛应用到肿瘤的研究当中。例如，Lu等人利用了骨肉瘤组织的细胞外基质作为3D打印的生物墨水，制备了富含胶原蛋白和低DNA/氨基葡萄糖含量的去细胞化骨肉瘤细胞外基质-纤维蛋白水凝胶，通过改基质建立的micro-骨肉瘤芯片系统能够在体外精准模拟骨肉瘤免疫微环境，并根据算法成功预测芯片中抗肿瘤药物的浓度变化[54]。该模型的建立能够为未来高通量检测肿瘤药物反应和预测疗效、分析免疫微环境靶点提供支持。

与该模型类似地，近期研究者们开发出了一种开放式3D微流控平台ODSEI芯片[55]，用于在肿瘤球体与内皮细胞之间建立互动模型，并能够阵列化生成超过1000个均一的肿瘤球体，通过两个多孔膜层进行物理分隔和溶解因子的扩散控制，以模拟体内微环境。后续通过单细胞RNA测序和蛋白阵列分析，揭示了TNF-α/NF-κB及mTOR信号通路在耐药性中的关键角色，并通过中和IL-8及TIMP-1显著逆转了肿瘤耐药性。该平台为药物筛选及肿瘤生物学研究提供了高效、可控的解决方案，通过与患者衍生细胞的结合，该平台有望推动个性化医疗的发展，为精准治疗提供更可靠的数据支持。

骨肉瘤等多种实体瘤的免疫抑制肿瘤微环境（ITME）是影响现有免疫治疗效果的一个重要障碍，如上文所述，尽管尝试了各种新的免疫策略，如免疫检查点抑制剂和肿瘤疫苗等，但由于同时从肿瘤和免疫系统减轻ITME负荷障碍巨大，各种治疗效果仍然有待提升。

近期Liu等人[56]的研究发现，通过诱导免疫原性细胞死亡和激活cGAS-STING通路促进抗肿瘤免疫有望成为对抗ITME和刺激全身抗肿瘤免疫反应的潜在策略。该研究中制备了一种基于双金属多酚的纳米平台（Mn/Fe-Gallate纳米颗粒包被肿瘤细胞膜，MFG@TCM），MFG@TCM结合轻度光热疗法（PTT），同时诱导骨肉瘤细胞焦亡和激活DCs中的cGAS-STING通路来逆转ITME。本研究结合了新型抗肿瘤材料和肿瘤免疫微环境的特点，为未来开发低毒副作用、多系统的抗肿瘤方案提供了新思路。

Wang等人发表了一项基于（K,Na）NbO3（KNN）无铅压电材料的无创化学-压电协同催化疗法，该疗法利用可注射KNN纳米晶体，在外界超声刺激的作用下产生化学-压电催化效应的协同作用，最终产生活性氧基团（ROS）诱导细胞毒性，实现对骨肉瘤细胞凋亡的诱导和细胞毒性作用[57]。类似地，基于超声动力治疗（SDT）的二维压电Bi2MoO6纳米材料[58]，能够消耗内源性GSH破坏氧化还原稳态，使得GSH激活的BMO NRs （GBMO）呈现缺氧结构，促进电子-空穴对的分离，从而提高SDT中ROS的产生效率，提高抗肿瘤作用（图10）。

此外，Liu等人在骨肉瘤肺转移研究中，利用基因表达矩阵的特征选择算法的机器学习，应用解释癌症基因组图谱计划（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO）的数据并构建预测网络，揭示了所选基因之间的潜在关系，并对特征基因进行富集分析、生存分析和免疫浸润；据此预测不同基因表达及免疫微环境患者的预后和治疗策略分析[59]。

图10 基于SDT的Bi2MoO6压电纳米材料在肿瘤治疗中的应用

总结与展望

骨与软组织肿瘤作为相对罕见的肿瘤类型，近年来被越来越多地深入探讨和研究，在诸多领域均有了重要突破和显著进展。其中包括各种免疫节点抑制剂的研究和应用、肿瘤发生发展的分子机制、液体活检、化疗药及靶向药耐药的机制探讨、纳米材料递送和动力学治疗的开发、肿瘤免疫微环境的调节等。随着材料学、多组学、AI如DeepSeek和ChatGPT等学科在各医药领域的广泛应用逐步加深，及交叉学科研究和新型诊疗措施的不断发展，骨与软组织肿瘤的诊疗方式正在发生革命性的变化。未来，肿瘤学、免疫学、分子生物学和数据科学等领域的紧密合作将进一步推动精准医学的发展，实现个性化治疗，降低治疗毒性的同时提高肿瘤患者生存率。

参考文献

[1] CHEN C, GUO Y, HUANG Q, et al. PI3K inhibitor impairs tumor progression and enhances sensitivity to anlotinib in anlotinib-resistant osteosarcoma [J]. Cancer letters, 2022, 536: 215660.

[2] 徐海荣, 肿瘤综合治疗电子杂志牛 J. 2023年度骨与软组织肿瘤诊治新进展 [J]. 2024, 10(2): 46-53.

[3] MARTINS-NEVES S R, SAMPAIO-RIBEIRO G, GOMES C M F. Self-Renewal and Pluripotency in Osteosarcoma Stem Cells' Chemoresistance: Notch, Hedgehog, and Wnt/β-Catenin Interplay with Embryonic Markers [J]. International journal of molecular sciences, 2023, 24(9).

[4] WANG X, QU Z, ZHAO S, et al. Wnt/β-catenin signaling pathway: proteins' roles in osteoporosis and cancer diseases and the regulatory effects of natural compounds on osteoporosis [J]. Molecular medicine (Cambridge, Mass), 2024, 30(1): 193.

[5] WEI Z, XIA K, LIU W, et al. CGREF1 modulates osteosarcoma proliferation by regulating the cell cycle through the Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. Molecular medicine (Cambridge, Mass), 2024, 30(1): 260.

[6] LEE S, RICCI B, TRAN J, et al. Stroma-derived Dickkopf-1 contributes to the suppression of NK cell cytotoxicity in breast cancer [J]. Nature communications, 2025, 16(1): 1183.

[7] GOLDSTEIN S D, TRUCCO M, BAUTISTA GUZMAN W, et al. A monoclonal antibody against the Wnt signaling inhibitor dickkopf-1 inhibits osteosarcoma metastasis in a preclinical model [J]. Oncotarget, 2016, 7(16): 21114-23.

[8] SHIRAI R, BIEBIGHAUSER T, WALKER D, et al. Cadherin-11 contributes to the heterogenous and dynamic Wnt-Wnt-β-catenin pathway activation in Ewing sarcoma [J]. PloS one, 2024, 19(6): e0305490.

[9] ZHANG J, LI N, LU S, et al. The role of Notch ligand Jagged1 in osteosarcoma proliferation, metastasis, and recurrence [J]. Journal of orthopaedic surgery and research, 2021, 16(1): 226.

[10] TRINDADE A, DUARTE A. Notch Signaling Function in the Angiocrine Regulation of Tumor Development [J]. Cells, 2020, 9(11).

[11] ZHUO B, WANG X, SHEN Y, et al. Interleukin-24 inhibits the phenotype and tumorigenicity of cancer stem cell in osteosarcoma via downregulation Notch and Wnt/β-catenin signaling [J]. Journal of bone oncology, 2021, 31: 100403.

[12] YANG J, HU Y, WANG L, et al. Human umbilical vein endothelial cells derived-exosomes promote osteosarcoma cell stemness by activating Notch signaling pathway [J]. Bioengineered, 2021, 12(2): 11007-17.

[13] HUANG X, XIA K, WEI Z, et al. SLC38A5 suppresses ferroptosis through glutamine-mediated activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling in osteosarcoma [J]. Journal of translational medicine, 2024, 22(1): 1004.

[14] PAN S, ZOU Z, ZHOU X, et al. Therapeutic impacts of GNE‑477‑loaded H(2)O(2) stimulus‑responsive dodecanoic acid‑phenylborate ester‑dextran polymeric micelles on osteosarcoma [J]. International journal of molecular medicine, 2024, 54(2).

[15] SCHULTE A, EWALD F, SPYRA M, et al. Combined Targeting of AKT and mTOR Inhibits Proliferation of Human NF1-Associated Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumour Cells In Vitro but not in a Xenograft Mouse Model In Vivo [J]. International journal of molecular sciences, 2020, 21(4).

[16] PALOMBO R, PASSACANTILLI I, TERRACCIANO F, et al. Inhibition of the PI3K/AKT/mTOR signaling promotes an M1 macrophage switch by repressing the ATF3-CXCL8 axis in Ewing sarcoma [J]. Cancer letters, 2023, 555: 216042.

[17] JENG K S, SHEEN I S, LEU C M, et al. The Role of Smoothened in Cancer [J]. International journal of molecular sciences, 2020, 21(18).

[18] WANG W, YAN T, GUO W, et al. Constitutive GLI1 expression in chondrosarcoma is regulated by major vault protein via mTOR/S6K1 signaling cascade [J]. Cell death and differentiation, 2021, 28(7): 2221-37.

[19] BANDAY S, MISHRA A K, RASHID R, et al. The O-glycosyltransferase C1GALT1 promotes EWSR1::FLI1 expression and is a therapeutic target for Ewing sarcoma [J]. Nature communications, 2025, 16(1): 1267.

[20] GILIBERTI G, MARRAPODI M M, DI FEO G, et al. Curcumin and Methotrexate: A Promising Combination for Osteosarcoma Treatment via Hedgehog Pathway Inhibition [J]. International journal of molecular sciences, 2024, 25(20).

[21] ZHAO Z, JIA Q, WU M S, et al. Degalactotigonin, a Natural Compound from Solanum nigrum L., Inhibits Growth and Metastasis of Osteosarcoma through GSK3β Inactivation-Mediated Repression of the Hedgehog/Gli1 Pathway [J]. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 2018, 24(1): 130-44.

[22] DENG Q, LI P, CHE M, et al. Activation of hedgehog signaling in mesenchymal stem cells induces cartilage and bone tumor formation via Wnt/β-Catenin [J]. eLife, 2019, 8.

[23] CASTIELLA T, IRUZUBIETA P, MONLEóN E, et al. Stromal cells of giant cell tumor of bone show primary cilia in giant cell tumor of bone [J]. Microscopy research and technique, 2022, 85(3): 1065-74.

[24] CHEN C, XIE L, REN T, et al. Immunotherapy for osteosarcoma: Fundamental mechanism, rationale, and recent breakthroughs [J]. Cancer letters, 2021, 500: 1-10.

[25] WANG J, ZHANG H, SUN X, et al. Exosomal PD-L1 and N-cadherin predict pulmonary metastasis progression for osteosarcoma patients [J]. Journal of nanobiotechnology, 2020, 18(1): 151.

[26] ZHOU Q, XIAN M, XIANG S, et al. All-Trans Retinoic Acid Prevents Osteosarcoma Metastasis by Inhibiting M2 Polarization of Tumor-Associated Macrophages [J]. Cancer immunology research, 2017, 5(7): 547-59.

[27] YU S, YAO X. Advances on immunotherapy for osteosarcoma [J]. Molecular cancer, 2024, 23(1): 192.

[28] KAISTHA B P, KAR G, DANNHORN A, et al. Efficacy and pharmacodynamic effect of anti-CD73 and anti-PD-L1 monoclonal antibodies in combination with cytotoxic therapy: observations from mouse tumor models [J]. Cancer biology & therapy, 2024, 25(1): 2296048.

[29] PANAGI M, MPEKRIS F, VOUTOURI C, et al. Stabilizing Tumor-Resident Mast Cells Restores T-Cell Infiltration and Sensitizes Sarcomas to PD-L1 Inhibition [J]. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 2024, 30(11): 2582-97.

[30] TAKENAKA W, TAKAHASHI Y, TAMARI K, et al. Radiation Dose Escalation is Crucial in Anti-CTLA-4 Antibody Therapy to Enhance Local and Distant Antitumor Effect in Murine Osteosarcoma [J]. Cancers, 2020, 12(6).

[31] SORKHABI A D, SARKESH A, FOTOUHI A, et al. Cancer combination therapies by silencing of CTLA-4, PD-L1, and TIM3 in osteosarcoma [J]. IUBMB life, 2022, 74(9): 908-17.

[32] XIE L, CHEN C, LIANG X, et al. Expression and Clinical Significance of Various Checkpoint Molecules in Advanced Osteosarcoma: Possibilities for Novel Immunotherapy [J]. Orthopaedic surgery, 2023, 15(3): 829-38.

[33] XU J F, PAN X H, ZHANG S J, et al. CD47 blockade inhibits tumor progression human osteosarcoma in xenograft models [J]. Oncotarget, 2015, 6(27): 23662-70.

[34] XU J, SHI Q, LOU J, et al. Chordoma recruits and polarizes tumor-associated macrophages via secreting CCL5 to promote malignant progression [J]. Journal for immunotherapy of cancer, 2023, 11(4).

[35] WICKMAN E, LANGE S, WAGNER J, et al. IL-18R supported CAR T cells targeting oncofetal tenascin C for the immunotherapy of pediatric sarcoma and brain tumors [J]. Journal for immunotherapy of cancer, 2024, 12(11).

[36] TALBOT L J, CHABOT A, ROSS A B, et al. Redirecting B7-H3.CAR T Cells to Chemokines Expressed in Osteosarcoma Enhances Homing and Antitumor Activity in Preclinical Models [J]. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 2024, 30(19): 4434-49.

[37] LI S. Collagen-disruptive cell therapy: adoptive transfer of membrane-anchored, tumor cell surface vimentin-targeted interleukin 12-armed TILs suppress collagen expression to boost deep T-cell infiltration via dual signaling activation and significant CCKAR reduction [J]. Research square, 2024.

[38] LAM P Y, OMER N, WONG J K M, et al. Enhancement of anti-sarcoma immunity by NK cells engineered with mRNA for expression of a EphA2-targeted CAR [J]. Clinical and translational medicine, 2025, 15(1): e70140.

[39] YANG Y, ZHOU Y, WANG J, et al. CD103(+) cDC1 Dendritic Cell Vaccine Therapy for Osteosarcoma Lung Metastases [J]. Cancers, 2024, 16(19).

[40] MARTINEZ-VELEZ N, LASPIDEA V, ZALACAIN M, et al. Local Treatment of a Pediatric Osteosarcoma Model with a 4-1BBL Armed Oncolytic Adenovirus Results in an Antitumor Effect and Leads to Immune Memory [J]. Molecular cancer therapeutics, 2022, 21(3): 471-80.

[41] SUGIU K, TAZAWA H, HASEI J, et al. Oncolytic virotherapy reverses chemoresistance in osteosarcoma by suppressing MDR1 expression [J]. Cancer chemotherapy and pharmacology, 2021, 88(3): 513-24.

[42] KOMATSUBARA T, TAZAWA H, HASEI J, et al. p53-Armed Oncolytic Virotherapy Improves Radiosensitivity in Soft-Tissue Sarcoma by Suppressing BCL-xL Expression [J]. Acta medica Okayama, 2024, 78(2): 151-61.

[43] CHEN H, HU J, XIONG X, et al. SETD8 inhibits apoptosis and ferroptosis of Ewing's sarcoma through YBX1/RAC3 axis [J]. Cell death & disease, 2024, 15(7): 494.

[44] LI Z, LU H, ZHANG Y, et al. Blocking CXCR4-CARM1-YAP axis overcomes osteosarcoma doxorubicin resistance by suppressing aerobic glycolysis [J]. Cancer science, 2024, 115(10): 3305-19.

[45] NERLAKANTI N, MCGUIRE J J, BISHOP R T, et al. Histone deacetylase upregulation of neuropilin-1 in osteosarcoma is essential for pulmonary metastasis [J]. Cancer letters, 2024, 606: 217302.

[46] KIM Y Y, GRYDER B E, SINNIAH R, et al. KDM3B inhibitors disrupt the oncogenic activity of PAX3-FOXO1 in fusion-positive rhabdomyosarcoma [J]. Nature communications, 2024, 15(1): 1703.

[47] WANG B, QU X L, LIU J, et al. HOTAIR promotes osteosarcoma development by sponging miR-217 and targeting ZEB1 [J]. Journal of cellular physiology, 2019, 234(5): 6173-81.

[48] AN X, WU W, WANG P, et al. Long noncoding RNA TUG1 promotes malignant progression of osteosarcoma by enhancing ZBTB7C expression [J]. Biomedical journal, 2024, 47(3): 100651.

[49] TAN K, LU W, CHEN F, et al. CRISPR-Cas9 knockout screening identifies KIAA1429 as an essential gene in Ewing sarcoma [J]. Journal of experimental & clinical cancer research : CR, 2023, 42(1): 250.

[50] GRACA MARQUES J, PAVLOVIC B, NGO Q A, et al. The Chromatin Remodeler CHD4 Sustains Ewing Sarcoma Cell Survival by Controlling Global Chromatin Architecture [J]. Cancer research, 2024, 84(2): 241-57.

[51] WANG R, WANG D, BAI X, et al. Kinome-wide CRISPR-Cas9 knockout screens revealed PLK1 as a therapeutic target for osteosarcoma [J]. Cell death discovery, 2023, 9(1): 231.

[52] HAN Z, PENG X, YANG Y, et al. Integrated microfluidic-SERS for exosome biomarker profiling and osteosarcoma diagnosis [J]. Biosensors & bioelectronics, 2022, 217: 114709.

[53] XU Q, WANG Y, DOU S, et al. High-Viability Circulating Tumor Cells Sorting From Whole Blood at Single Cell Level Using Laser-Induced Forward Transfer-Assisted Microfiltration [J]. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), 2025: e2414195.

[54] LU Z, MIAO X, ZHANG C, et al. An osteosarcoma-on-a-chip model for studying osteosarcoma matrix-cell interactions and drug responses [J]. Bioactive materials, 2024, 34: 1-16.

[55] RO J, KIM J, PARK J, et al. ODSEI Chip: An Open 3D Microfluidic Platform for Studying Tumor Spheroid-Endothelial Interactions [J]. Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany), 2025: e2410659.

[56] LIU K, ZAN P, LI Z, et al. Engineering Bimetallic Polyphenol for Mild Photothermal Osteosarcoma Therapy and Immune Microenvironment Remodeling by Activating Pyroptosis and cGAS-STING Pathway [J]. Advanced healthcare materials, 2024, 13(22): e2400623.

[57] WANG S D, CHEN C L, WANG J, et al. Synergetic Chemo-Piezodynamic Therapy of Osteosarcoma Enabled by Defect-Driven Lead-Free Piezoelectrics [J]. Advanced Functional Materials, 2022, 32(44).

[58] DONG Y, DONG S, LIU B, et al. 2D Piezoelectric Bi(2) MoO(6) Nanoribbons for GSH-Enhanced Sonodynamic Therapy [J]. Advanced materials (Deerfield Beach, Fla), 2021, 33(51): e2106838.

[59] LIU G, WANG S, LIU J, et al. Using machine learning methods to study the tumour microenvironment and its biomarkers in osteosarcoma metastasis [J]. Heliyon, 2024, 10(7): e29322.

作者简介