摘要：RNA和DNA中的化学修饰在多种生物过程中发挥着关键作用，包括转录调控、RNA降解、蛋白质翻译和免疫调节等。这些修饰已被新的测序方法以单碱基分辨率定量地绘制出来，其中核苷酸脱氨基是一种高效策略，用于选择性地绘制DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcyto

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RNA和DNA中的化学修饰在多种生物过程中发挥着关键作用，包括转录调控、RNA降解、蛋白质翻译和免疫调节等。这些修饰已被新的测序方法以单碱基分辨率定量地绘制出来，其中核苷酸脱氨基是一种高效策略，用于选择性地绘制DNA中的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）和RNA中的N6-甲基腺苷（m6A）。然而，传统的化学脱氨基方法依赖于在苛刻的酸性条件下使用芳基重氮盐，这限制了其在大多数生物底物中的应用。近年来，基于亚硝酸盐离子的RNA测序方法（如NO-seq和NT-seq）虽然简单且成本效益高，但低转化效率和苛刻的酸处理可能会导致RNA降解，从而影响检测的准确性。此外，GLORI方法虽然提高了脱氨基效率和选择性，但仍受到RNA降解和逆转录停止的限制，需要大量的RNA输入。

为了开发一种温和的化学脱氨基反应，以克服传统方法的局限性。近日，芝加哥大学何川团队通过设计一种接近中性pH值的温和化学脱氨基反应，不仅可以显著保护RNA，还能提高信噪比，从而实现对m6A位点的灵敏且稳健绘制。这种方法有望为研究m6A修饰在基因表达调控中的作用提供有力的工具，推动RNA修饰领域的研究进展。相关成果以《Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA》为题，发表于Nature子刊《Nature Chemistry》。

标题：Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA

发表时间：2025-4-17

发表期刊：Nature Chemistry

影响因子：IF19.2/Q1

单位：芝加哥大学

研究方法

研究者采用一种N-亚硝化策略，通过羰基有机催化剂和路易斯酸催化剂的协同催化作用，实现对RNA中腺苷（A）的脱氨基反应，将其转化为次黄嘌呤（I）。这种方法被称为化学协同催化辅助m6A测序（chemical cooperative catalysis-assisted m6A sequencing，CAM-seq）。具体实验步骤如下：

图1：羰基有机催化剂和路易斯酸催化的一级胺协同脱氨基反应。

a. 在苛刻的酸性条件下，亚硝酸盐离子通过逐步的亚硝化和重氮化反应介导脱氨基作用。

b. 本研究和GLORI-seq：由羰基有机催化剂和路易斯酸（LA）催化的协同脱氨基反应。

c. 全转录组m6A测序的m6A-CAM-seq方法示意图。RNA样本被片段化，并在优化的条件下进行处理，随后进行纯化和测序文库制备。

研究结果

（1）温和条件下对底物进行一般脱氨基处理

研究者在温和条件下对多种核苷酸底物进行了脱氨基反应，发现甘油醛与硼酸三氟化物乙醚（BF3·OEt2）组合能高效脱氨基广泛的核苷酸底物。通过改变羰基催化剂，从二羰基有机催化剂改为单羰基有机催化剂（如糠醛），可以显著提高鸟苷类似物的脱氨基产率。研究者推测这可能是因为鸟苷类似物在位置6处可以与甘油醛环化，形成鸟苷-甘油醛加合物。

图2：由有机催化剂与路易斯酸共同催化的核苷酸脱氨基反应。

a-c. 以胞嘧啶（a）、腺苷（b）和鸟苷（c）及其类似物为底物的脱氨基反应范围。

d. 在优化的催化条件下，对甲基化核苷进行反应。

（2）阐明反应机制

通过15N核磁共振（NMR）光谱学跟踪反应过程，研究者发现，在没有路易斯酸的情况下，15N6腺苷与甘油醛的缩合反应非常缓慢，即使在50℃下加热2小时后，缩合产物的形成仍然很少。然而，加入BF3·OEt2后，15N标记的腺苷在半小时内迅速转化为中间体Int 3。二维1H-15N HMBC光谱学被用来监测路易斯酸催化的缩合反应，具有更高的15N灵敏度。在Na15NO2存在的情况下，15N亚胺信号消失，表明其转化为脂肪族硝基取代的中间体，并随后重排为N-亚硝化加合物。这些结果证实了通过亚胺中间体的反应路径。

图3：反应机制研究与催化循环。

a. 15N6腺苷脱氨基反应的一维15N核磁共振（NMR）谱图。

b. 提出的脱氨基反应的催化循环。

（3）DNA和RNA中腺苷脱氨基的选择性条件

研究者进一步探索了优化CAM-seq选择性条件，使其对腺苷的脱氨基反应具有更高的选择性。通过测试不同的路易斯酸，发现硼酸在提高反应活性方面最为有效。在硼酸存在的情况下，二羰基化合物比单羰基化合物具有更高的脱氨基效率。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，甘油醛和三氟丙醛都表现出对腺苷的选择性，但由于三氟丙醛导致的显著DNA/RNA降解，研究者选择了甘油醛进行进一步研究。在优化的脱氨基条件下，甘油醛在DNA和RNA中都表现出对腺苷的完全脱氨基反应，而m6A位点保持不变。

图4：在寡核苷酸中优化脱氨基条件。

a-b.在不同路易斯酸催化剂（a）和羰基有机催化剂（b）条件下，寡核苷酸中腺苷位点的突变比率。硼酸（红色轮廓）和甘油醛（蓝色轮廓）催化剂被选中进行进一步优化（n=4）。

c.不同羰基有机催化剂对A和C脱氨基的催化效率比较。二羰基催化剂在A位点的转化率高于C位点。

d.在优化条件下，6碱基DNA寡核苷酸CTCAGC表现出对G保护和A脱氨基的高反应性。

e.使用5碱基m6A RNA寡核苷酸探针（ACm6AGU），在与d相似条件下展示A和m6A的选择性。

f-h. LC–MS/MS监测DNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（f）、硼酸（g）和亚硝酸盐（h）浓度的优化（n=3）。

i-k. LC–MS/MS监测RNA寡核苷酸脱氨基反应中甘油醛（i）、硼酸（j）和亚硝酸盐（k）浓度的优化（n=3）。

（4）CAM-seq m6A检测的优化条件

研究者注意到，尽管甘油醛作为一种有机催化剂非常有效，但它倾向于与鸟苷形成加合物，这可能导致逆转录酶在逆转录过程中停止（RT stops）。因此，研究者选择了kethoxal作为保护基团，因为它具有更高的反应速率和更好的可逆性。在优化条件下，CAM-seq能够在接近中性的pH值下进行，显著减少RNA降解。通过测试11种不同的逆转录酶和3种不同的dNTP比例（dTTP/dCTP比例为1:1、1:40和1:400），研究者发现RevertAid RT在dTTP/dCTP比例为1:40时，背景噪声水平最低，约为0.36%。

图5：CAM-seq 协议的优化。

a. 使用甘油醛保护的G位点的RNA寡核苷酸探针测试了逆转录（RT）停止情况。

b. 使用kethoxal保护的RNA寡核苷酸探针在与a相似的条件下展示了RT停止比率。

c-f. 在中性条件下，使用甘油醛（c,d）和kethoxal（e,f）对DNA寡核苷酸的笼化（caging）（c,e）和去笼化（decaging）（d,f）动态比较。

g. 在中性条件下，甘油醛对kethoxal完全笼化的DNA寡核苷酸的竞争。

h-i. 使用完整的RNA（h）和200个核苷酸片段化的RNA（i）进行RNA降解实验。

j. 通过插入寡核苷酸测序数据优化逆转录酶条件。测试了11种逆转录酶和3种dTTP/dCTP比例（1:1、1:40和1:400）。一个突出的条件（RevertAid RT在1:40比例下）显示出低于0.36%的背景噪声水平。

（5）人、拟南芥、玉米等不同物种转录组中的m6A全面图谱

使用优化的CAM-seq协议，研究者在人类HEK293T细胞系中鉴定了282281个高度可信的m6A位点（P＜0.001）。其中，235173个和180056个位点的修饰比例分别大于5%和10%。GAC motif最为富集，占HEK293T转录组中可信位点的54%，其次是AAC motif，占27%。值得注意的是，YAC（CAC/UAC）和RAU（GAU/AAU）motif，这些与RAC motif仅相差一个核苷酸的motif，也显示出一定程度的m6A修饰。在人类转录组中，m6A富集的motif（如GAC）在3'-UTR区域的终止密码子附近表现出明显的富集信号，进一步证实了CAM-seq能够提供整个转录组的高质量m6A图谱。

研究者还对拟南芥和玉米的RNA样本进行了分析，发现RAC motif在这些植物中也是最富集的m6A修饰motif。然而，与人类样本不同的是，RAC motif仅占植物中所有m6A位点的40%，而在人类样本中约为85%。此外，植物中AAC motif丰度最高，而在人类中则是GAC motif丰度最高。这些结果表明，植物中的m6A修饰模式与人类存在差异，可能与植物中m6A修饰的调控机制有关。

图6：m6A修饰的精确定量揭示了在motif水平上的m6A沉积。

a. 所有A位点（覆盖度＞20）的m6A修饰水平分布，以GAC和UAG motif为例。

b. 多种方法检测到的m6A位点与估计背景噪声的比较。

c. CAM-seq和GLORI-seq在126362个重叠位点上m6A水平的相关性（r=0.883）。红色虚线表示相等水平。红色三角形标记的区域突出了GLORI-seq高估m6A水平的位点。

d. 在三种基于脱氨基的方法中观察到的所有m6A位点中，AAC motif的比例，计算为所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和与所有位点的（m6A比率×覆盖率）之和的比值。

e. 人类样本中所有A位点（无过滤）的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。GAC和AAC motif（红色）高于背景水平。整体m6A水平表示为0.41%。

f-g. 拟南芥（f）和玉米（g）中所有A位点的平均甲基化水平与相对motif频率的关系。整体m6A水平分别表示为0.77%和0.69%。

h. 人类、拟南芥和玉米中通过过滤的16 three-letter motif的频率与平均甲基化水平之间的关系。

i-k. 人（i）、拟南芥（j）和玉米（k）中相对于m6A位点的每个位置核苷酸重要性评分。

（6）饱和分析将转录速率与m6A水平关联分析

研究者通过饱和m6A图谱分析发现，基因表达水平与平均m6A水平呈负相关。具体来说，高转录率基因倾向于具有较低m6A水平，可能是由于m6A沉积复合物的可用性有限，或者甲基转移酶复合物与转录机制在细胞内的动态关联。此外，研究者还发现，基因的最大m6A修饰水平可以作为区分基因的一个重要参数。将基因分为两组：一组是所有m6A位点的修饰水平普遍较低的基因，另一组是具有高修饰潜力的基因。这两组基因的表达水平与m6A水平都呈现出显著的负相关性。

图7：影响m6A变化的因子。

a. 插图展示了A位点的区域和基因分布如何影响基因中m6A修饰水平的变异。

b. 基于meta基因分析，终止密码子附近的-20到+180核苷酸区域被确定为m6A沉积的热点区域。

c. 基因间和单个基因内的变异对应数据。

d. log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系，以等高线图表示，并带有虚线趋势线。

e. 所有基因的最大m6A修饰水平分布。低甲基化和高甲基化组的拟合曲线分别用蓝色和红色虚线标记。

f. 基因内平均m6A修饰水平与最大m6A修饰水平之间的相关性。

g-h. 仅低修饰基因（g）和仅高修饰基因（h）的log10基因表达水平与平均m6A水平之间的关系。

i. 所有基因（黑色）、无m6A修饰基因（蓝色）、低m6A修饰基因（黄色）和高m6A修饰基因（红色）的m6A水平与基因表达之间的总体关系。

CAM-seq、NO-seq、NT-seq、GLORI、MeRIP-seq等m6A测序方法介绍及比较

（1）CAM-seq（化学协同催化辅助的m6A测序）

原理：通过化学协同催化策略，利用羰基催化剂和路易斯酸催化剂的协同作用，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），而m6A位点抵抗脱氨基反应，保持为腺苷。通过逆转录酶或DNA聚合酶读取时，I被读作鸟嘌呤（G），从而实现m6A检测。

优点：

温和条件：反应在接近中性的pH值下进行，避免了RNA降解。

低背景噪声：背景噪声低至0.5%，远低于其他方法。

低输入量：仅需10ng的RNA输入即可实现高分辨率检测。

高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。

应用场景：

适用于低输入量的RNA样本，如单细胞RNA测序、微量组织样本等。

（2）NO-seq（硝酸盐介导的m6A测序）

原理：通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。

优点：

操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。

成本低：试剂成本较低。

缺点：

反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。

背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。

（3）NT-seq（硝酸盐介导的转录组测序）

原理：与NO-seq类似，通过硝酸盐离子介导的化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。

优点：

操作简单：不需要复杂的酶反应步骤。

成本低：试剂成本较低。

缺点：

反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。

背景噪声高：由于反应不完全，背景噪声较高，影响检测准确性。

（4）GLORI（化学保护基团介导的m6A测序）

原理：通过化学保护基团（如甘油醛）保护鸟苷（G），然后进行化学脱氨基反应，将RNA中的腺苷（A）转化为次黄嘌呤（I），从而实现m6A的检测。

优点：

选择性高：通过保护基团的选择性保护，提高了脱氨基反应的选择性。

高灵敏度：能够检测到低比例的m6A修饰位点。

缺点：

反应条件苛刻：需要在酸性条件下进行，可能导致RNA降解。

背景噪声高：由于保护基团的不完全去除，可能导致背景噪声较高。

高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。

（5）MeRIP-seq（m6A免疫沉淀测序）

原理：通过特异性的m6A抗体对RNA进行免疫沉淀，然后通过高通量测序检测m6A修饰位点。

优点：

全转录组：能够实现全转录组的m6A检测。

广泛适用：适用于多种类型的RNA样本。

缺点：

高输入量：需要较多的RNA输入量（通常为微克级别）。

背景噪声高：由于抗体的非特异性结合，可能导致背景噪声较高。

操作复杂：需要进行免疫沉淀步骤，操作较为复杂。

#基础技术方法论专题 #m6A专题

关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术

易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。

易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：

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研究方向：

m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究

关于m6A甲基化研究思路

（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析

（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示

（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略

（4）进一步验证或后期试验

易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。

参考文献：Wang, P., Ye, C., Zhao, M. et al. Small-molecule-catalysed deamination enables transcriptome-wide profiling of N6-methyladenosine in RNA. Nat. Chem. (2025).

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来源：易基因科技