摘要：近年来，3D细胞培养物比常规2D细胞培养物能够更真实地代表复杂组织或器官的能力而得到普及。美国华盛顿大学Jonathan T. C. Liu等人在《Nature Methods》期刊综述了应用二维和三维显微镜方法监测和研究3D细胞培养。文章介绍

近年来，3D细胞培养物比常规2D细胞培养物能够更真实地代表复杂组织或器官的能力而得到普及。美国华盛顿大学Jonathan T. C. Liu等人在《Nature Methods》期刊综述了应用二维和三维显微镜方法监测和研究3D细胞培养。文章介绍

题目：Imaging 3D cell cultures with optical microscopy

期刊：Nature Methods

影响因子：36.1

发表日期：2025年4月

细胞培养技术已经远超早期简单的2D单层，能够模拟复杂的体内组织环境的几乎所有特征，越来越能够取代动物模型。但其增加的复杂性、组织层和尺寸或厚度也带来了成像挑战。2D和3D显微镜方法能够监测细胞水平的行为以及器官水平的生理学。

本综述集中于四类3D细胞培养模型：先进的2D培养、球体和类器官、类器官芯片和切片培养（图1），它们都具有相关的成像挑战。

先进的2D培养表现出一个或多个成像挑战，例如存在多个细胞层或在拓扑结构复杂和厚表面上生长的细胞。

周围的光散射基质，结构的异质尺寸和形状，以及在多个焦平面上以亚细胞分辨率成像的愿望，为类器官和球体创造了独特的成像挑战。

类器官芯片的无数芯片设计和格式带来了更多成像要求：具有多层装置的复杂外壳元件、具有相邻流体区的大尺寸组织以及具有大量不透明或散射的复杂天然或合成支架；以及创新和灵活的显微镜设计，染色方法和分析管道。

切片培养，来自切除的初级组织。组织切片的成像也具有挑战性。

图1 2D和3D显微镜下的3D细胞培养模型图示。

一、用于3D细胞培养的常用光学显微镜方法

2D和3D光学显微镜技术的主要类别有：透射光显微镜、落射荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、多光子显微镜、薄片荧光显微镜，这些技术在高级细胞培养研究中普遍存在（图2）。

1、透射光显微镜

透射光显微镜（TLM）是生物实验室中最常用的二维成像显微镜技术。薄的和半透明的标本（如单层细胞）很容易使用TLM可视化，而较厚的样品（大于几百微米）内的结构可能由于缺乏光学切片（拒绝或抑制失焦的背景信号）而出现部分或完全不透明。对于3D培养物，2D显微镜方法如TLM和荧光显微镜的深度分辨率有限，无法评估结构的高度或创建样品的侧视图。

2、落射荧光显微镜

在落射荧光显微镜中，使用显微镜物镜在特定的激发波长照射组织样本，并且通过相同的物镜透镜收集由该激发光产生的荧光信号。无需光学切片即可实现样品的2D投影视图。

落射荧光显微镜可以对特定的组织组织靶标进行荧光标记，以产生与非荧光（未标记）背景相关的信号，从而允许对这些标记的对象进行高对比度成像，而且落射荧光显微镜不需要激光扫描或脉冲激光。

3、共聚焦荧光显微镜

共焦显微镜将光聚焦到组织内的一个小点，并通过放置在收集路径内的中间图像平面上的针孔将该焦点处产生的荧光信号成像。扫描光焦点能够生成2D图像，同时在各个焦平面处堆叠2D图像产生体积成像数据。

然而，共焦荧光显微镜通常是昂贵的，并且通常具有有限的成像速度。此外，存在大量被针孔拒绝的浪费光，不能用于信号生成。这种过量的背景光穿过组织样本可导致光损伤和光漂白。

4、多光子显微镜

在多光子显微镜中，同时吸收多个光子才能产生感兴趣的荧光信号，这仅在光子通量非常高时才能发生。因此，失焦光的产生受到抑制，并且可以通过扫描样本内的紧密焦点来生成高分辨率3D图像。多光子显微镜的缺点是成像速度慢和成本高。

5、光片荧光显微镜

光片荧光显微镜（LSFM）系统用薄片光照射样品，选择性地激发该片中的荧光团，然后将其在相对大的2D平面上对灵敏的检测器阵列进行成像。光片显微镜具有更大的设计灵活性，且光学效率高，光浪费少。然而，LSFM成本高，而且LSFM不能有效地拒绝或抑制多重散射的背景光，因此样品必须是透明的。

图2 光学图，用于对3D细胞培养模型成像的常见2D和3D显微镜方法的特征和示例。

二、2D与3D显微镜技术用于不同的研究方案

不同显微镜技术之间的成像挑战和取舍高度依赖于应用。本综述概述了应用3D细胞培养的光学显微镜的四个广泛的示例领域：发育生物学、感染生物学、药理学和癌症生物学。

1、发育生物学

先进的2D培养和类器官作为传统模式生物的替代品，由于获得效率和伦理问题而具有挑战性。复杂的类器官芯片系统可以提供更现实和更详细的微环境。对于这些复杂的工程结构，需要细胞分离的分析通常不如基于原位和体外成像的分析。

形态发生

延时容积成像通常是研究三维细胞培养中形态发生的理想方法。形态发生可跨越数天甚至数周，所以以适度的时间间隔捕获图像序列可足以捕获相关动态。然而，光漂白和光毒性是两个潜在的挑战。因此，使用LSFM能够最大限度地减少光漂白和光毒性。例如，使用细胞核标记技术的LSFM对发育中的大脑类器官进行了几天的成像，并追踪了与大脑各部分相关的细胞谱系。

由于波前像差和光散射，许多显微镜无法容纳大型3D样本和/或清晰地可视化培养物的更深区域。在脑类器官中，其内部区域的细胞核不易区分（图3a）。此外，在类器官芯片中使用的支架和富含基质的基底可能会增加组织或成像路径的折射不均匀性。

图3 不同研究领域中使用的成像3D细胞培养物。

基因的功能

目前，2D空间基因组学和转录组学允许显微镜用于大量靶标的高通量筛选以及少量基因的靶向成像。使用活成像和终点成像来研究少量的分子靶点，通过LSFM来分辨和量化单个细胞中的基因表达。

在检查单个干细胞肠道类器官发育的研究中，LSFM被用于观察干细胞标记物在几天内的时空表达动态，以阐明其在器官发育中的关键作用。通常需要在大的3D细胞培养物上识别感兴趣的区域，尤其是对于大样本中的罕见事件，突出了定制多尺度成像工作流程的需求，可能通过计算管道实现自动化。

2、感染生物学

球状体和类器官可用于在感染期间模拟多细胞类型或器官环境。此外，更复杂的类器官芯片模型可用于研究器官系统，包括感染后宿主免疫系统的反应。切片培养可用于研究亚器官区域。

病毒感染

在3D细胞培养模型中对病毒感染的研究包括分析病毒拷贝和靶向细胞类型或区域以及宿主中的结构和基因表达变化。共聚焦显微镜已经被用于量化病毒和宿主细胞之间存在的复杂和异质的关系。

在一项探索人类结肠类器官中病毒感染的研究中，共聚焦显微镜用于观察病毒的分布和感染后固定结肠类器官的结构，鉴定了一种新的抗感染机制，涉及受感染细胞的挤出。畸变或散射的问题是一个挑战。组织清除方法可减轻畸变和散射，以分析固定的3D细胞培养物。

细菌和寄生虫感染

LSFM可以最大限度地减少了光漂白和光毒性，并且其分辨率通常足以用于细菌和原生动物，高成像速度对于捕获快速入侵的某些细菌或寄生虫的运动可能是有价值的。在一项调查致命细菌感染机制的研究中，研究人员使用延时LSFM观察肠道类器官内细菌的位置，揭示了以前未知的感染途径（图3b）。然而，需要解决组织散射和波前像差等问题。

图3 不同研究领域中使用的成像3D细胞培养物。

另一个挑战是在空间上定位感兴趣的宿主-病原体相互作用。自动化的多尺度工作流程在这种情况下可能很有价值。此外，高通量成像方法具有研究个性化治疗或筛选候选药物以对抗感染的潜力。

3、药理学

类器官芯片模型可用于更深入地研究少数候选药物的影响，包括其功效，毒性和作用机制。然而，由于其更大的尺寸和空间复杂性，光学挑战充满了创新的机会。最近的技术，如显微切割的“长方体”模型与微流体处理相结合，为研究药物对大量原代组织培养物的影响提供了希望。

疗效和毒性

主要使用疾病模型来研究药物功效，肝脏和肾脏模型来研究药物毒性。对于可以通过细胞群指标（如活力）充分表示的药物效应，宽视场2D荧光成像是理想的。三维显微镜可用于评估药物诱导的形态或结构变化，对特定细胞类型的影响或病理特征，如共聚焦显微镜已被应用于评估肠芯片模型中的绒毛高度，作为药物抑制辐射损伤能力的量度（图3c）。

图3 不同研究领域中使用的成像3D细胞培养物。

作用机制

非成像的方法，如质谱法和RNA测序，通常用于评估代谢或基因表达变化，并确定潜在的机制途径。对于提供有价值的空间背景的基于显微镜的研究，治疗组和未治疗组的终点分析是常见的。

共聚焦荧光或多光子显微镜可能是最佳选择，因为它们在厚组织中具有高水平的分辨率和光学切片能力。在一项研究中，共聚焦显微镜检测到药物治疗后辐射损伤的肠道芯片模型中活性氧水平的降低，这提示了可能的反应途径。

4、肿瘤生物学

显微镜技术通常用于评估癌细胞的运动性，特别是在侵袭和转移的背景下。成像方法还有助于检查肿瘤组织内的细胞相互作用。

肿瘤的侵袭和转移

TLM已被应用于量化乳腺癌细胞对类器官芯片模型中基质区域的侵袭距离，从而提供对侵袭机制的见解。在侵袭试验结束时，固定样本的高分辨率3D成像也常用于研究肿瘤细胞内的结构和分子生物标志物。共聚焦显微镜也是一个选择，它提供了高分辨率和光学切片能力。波前像差和散射的问题可以通过应用于固定标本的光学清除方法来避免。

血管生成和血管变化

标准2D落射荧光显微镜可适用于许多需要基本血管指标的研究。对于血管形态的细微变化的细微检查，可能需要3D显微镜。例如，使用共聚焦显微镜分析肿瘤血管系统的复杂网络，以评估抗血管生成RNA纳米颗粒的作用。对于血管生成的大规模分析或肿瘤细胞对血管的选择，则需要高通量LSFM，特别是如果在时间和数据效率高的多尺度工作流程中进行。

成纤维细胞和ECM

非成像方法，如定量实时逆转录聚合酶链反应，通常用于检查成纤维细胞或肿瘤细胞的表达谱。成像技术主要用于表征ECM或成纤维细胞结构。共焦显微镜和多光子显微镜通常是优选的。在一项研究中，研究人员检查了热疗法对胰腺肿瘤球体的影响，采用多光子显微镜来量化胶原纤维的变化，从而深入了解热治疗的潜在机制。

癌症-免疫相互作用

三维显微镜对于提供对肿瘤-免疫相互作用的全面空间见解是有价值的。例如，在专注于鉴定增强工程化T细胞对患者来源的肿瘤类器官的功效的基因的研究中，共聚焦显微镜被应用于在单细胞水平上量化具有不同遗传修饰的T细胞（对类器官）的杀伤行为（图3d）。在这种情况下，需要快速延时成像以捕获具有最小光漂白和光毒性的细胞杀伤过程，LSFM可能是理想的成像方式。

图3 不同研究领域中使用的成像3D细胞培养物。

三、技术前景

本综述探讨了解决上述挑战的三个技术领域：像差校正和散射缓解，多尺度成像和多路复用成像。并概述了一些有前途的方法及目前的技术差距，强调未来发展的需求和机会。

1、像差校正和散射减轻

像差校正是通过专门的“自适应元件”产生反向波前图案以抵消像差，或通过直接调节光学部件的位置和/或角度以优化成像系统的对准。基于AO的显微镜方法已被应用于具有高结构复杂性的动物模型的体内成像，解决3D细胞培养物中畸变的潜力。

一种基于AO的LSFM系统已经用于成像类器官（图4a），捕获几分钟内细胞摄取的动态变化。减少光散射是一项挑战，常用策略是使用近红外区域的长波长。多光子LSFM使用近红外光片来提高成像深度，同时保持低光漂白和光毒性。此外，在LSFM中整合共焦门控技术可用于改善对散射背景的抑制。另一种策略是从多个方向对样本成像。例如，一些胚胎研究采用了具有双侧照明收集的LSFM来解决组织散射问题，同时采用了AO来解决像差和样本诱导的错位问题（图4b）。然而，这种策略仅限于具有特定几何形状和尺寸的样本。

近几十年来已经开发了新技术来消除组织中的光散射效应，包括使用荧光或超声“导星”。最具挑战的是，这需要恒定且快速地更新定制生成的照明模式以抵消散射的影响。此外，还可以通过适当地共同设计3D培养和成像系统的来缓解像差或散射问题。

类器官芯片系统的一些新设计不是将细胞沿z轴作为多层进行空间排列，而是在x-y平面中排列功能亚单位，以实现最佳的光穿透，并随着时间的推移对感兴趣的结构和/或过程进行成像。微生物工程支架或结构可以应用于3D培养物，以引导类器官在沿同一焦平面的预定义位置形成，极大地促进高通量和高含量成像。

图4 三维细胞培养的像差校正和散射减缓技术的原理。

2、多尺度成像

得到大样本体积内的感兴趣区域，通常需要多尺度成像。低分辨率成像能够快速检查大样本区域或体积，以最小的光毒性和时间确定感兴趣的区域。然后，高分辨率成像能够对这些局部区域进行详细和定量分析（图5a）。

最近的一项研究中，一种新型的多孔板，配备了微镜，这种自动多尺度成像流水线用于识别肠类器官发育期间的罕见细胞聚集事件（图5b）。此外，将超分辨率技术整合到多尺度成像中可以扩大3D细胞培养中可观察的范围，同时保持对感兴趣区域的有效识别。

多尺度成像的一种方法是使用单个物镜（和单个成像路径）来实现高分辨率和大视场。带有物镜转台的多尺度成像通常用于传统的显微镜模式，如落射荧光和共聚焦显微镜。最近还开发了一种多尺度“混合”OTLS显微镜系统，其特点是在一个系统中集成了低分辨率和高分辨率成像臂，消除了机械切换物镜的需要（图5c）。

LFM使用一种新颖的光学配置，以极高的体积帧速率从单个相机曝光中计算重建3D图像，用于表征单个活细胞中的线粒体动力学，证明了LFM的可扩展性。然而，LFM可能难以处理标记密集的厚标本。

图5 三维细胞培养中多尺度成像的原理和应用。

3、多路复用成像

新兴的多路成像方法可用于研究单个标本中的多个靶点。可根据是否需要在活体或固定的状态下检查3D培养物选择不同的策略。免疫荧光成像具有高分子特异性，并能同时可视化多种分子的分布，但其通常限于可见光谱，并且在大多数情况下可以容纳多达大约五个荧光团的激发和发射光谱。

高度多重免疫荧光策略已应用于固定类器官的薄片，使用连续的染色循环和每个循环三至五个探针的成像，其中荧光在每个循环之间失活以避免光谱重叠（图6a）。或使用条形码化抗体进行单轮染色，并使用互补荧光寡核苷酸通过条形码的顺序读出。多路复用还可与空间转录组学相结合，以绘制跨组织的mRNA分布。然而，这些方法中染色和/或成像的迭代性质对于较厚的3D细胞培养物可能是过度耗时的。

活3D培养物的多路复用成像依赖于少数生物相容性荧光分子和少量但不断增长的遗传表达荧光蛋白。几种有前途的方法是使用先进的光学硬件和软件来辨别样品中化学物质重叠光谱之间的细微差异。例如，通过使用可调谐滤波器或使用高光谱成像检测器快速改变光的激发波长来在每个时间点容纳更多的荧光团。需要计算算法来解混来自具有重叠激发或发射光谱的多个荧光团的信号（图6b）。目前仅限于识别五到十种化学物质。

3D培养的研究将受益于同时对更多目标染色和成像的能力，从而比循环方法更快地进行分析。最近开发的一种方法证明了使用新型荧光半导体聚合物点探针的单轮21通道成像。在未来，人工智能模型可用于预测分子表达模式和表型（图6c）。

图6 高复用成像原理及其在3D细胞培养中的应用。

4、计算增强显微镜

计算增强显微镜是指将先进的软件与传统的显微镜技术相结合，以克服某些硬件限制和实际成像挑战，从而改进图像采集、分析和解释。将去卷积显微镜用于2D和3D显微镜，通过计算消除像差和散焦的光的影响来提高分辨率和对比度。

聚焦信号和背景信号之间的这种差异允许在获取一个或多个图像之后计算去除背景，并且在某些情况下还允许分辨率增强。与可见光和近红外探测器共染色的组织目标的图像通常只能通过近红外成像才能获得。

生物学家可以继续依赖流行的可见荧光剂和荧光蛋白，它们往往比近红外荧光团更亮，且更易获得。这些多尺度成像策略迄今为止仅应用于细胞单层，有望在3D细胞培养中进行优化。

基于计算机的虚拟染色的蓬勃发展领域，有望简化3D细胞培养中的染色和成像工作流程。将AI集成到3D细胞培养成像中的一个主要挑战在于需要大量的数据。计算增强显微镜的有效应用将需要在硬件和软件开发方面的共同努力，包括硬件-软件协同设计。

四、总结

本综述通过讨论生物学家最终用户的技术需求，沿着现有显微镜方法在特定用例中的优缺点，确定了未来技术发展可能产生重大影响的领域，包括需要对抗组织散射和像差的影响，以在3D标本内深入成像，需要多分辨率工作流程来有效地询问大体积，需要改进的多路复用成像策略来分析各种细胞类型和组织结构之间的关系，最后需要结合计算方法，包括AI，以促进所有这些进步以及其他工作流程。

参考文献

Hsieh HC, Han Q, Brenes D, Bishop KW, Wang R, Wang Y, Poudel C, Glaser AK, Freedman BS, Vaughan JC, Allbritton NL, Liu JTC. Imaging 3D cell cultures with optical microscopy. Nat Methods. 2025 Apr 17. doi: 10.1038/s41592-025-02647-w.

来源：培养盒守护者