南京工业大学Journal of Controlled Release：水蛭仿生微针递送水蛭素融合蛋白前药用于长期抑制血栓形成

摘要：近日，南京工业大学药学院田雪老师、高兵兵副教授、姜天玥教授在抗血栓治疗领域取得重要突破。受水蛭口器独特吸血机制的启发，该团队创新性地开发了一种基于水蛭素融合蛋白前药的仿生微针贴片给药系统。该研究构建了一种具有智能响应特性的前药水蛭素融合蛋白，可实现按需激活抗凝

近日，南京工业大学药学院田雪老师、高兵兵副教授、姜天玥教授在抗血栓治疗领域取得重要突破。受水蛭口器独特吸血机制的启发，该团队创新性地开发了一种基于水蛭素融合蛋白前药的仿生微针贴片给药系统。该研究构建了一种具有智能响应特性的前药水蛭素融合蛋白，可实现按需激活抗凝活性，并通过仿生设计将前药水蛭素融合蛋白与微针透皮递送技术相结合，简化了传统抗凝药物的给药方式，开发了一种长效抗血栓治疗的新策略。这一突破性进展为临床的抗凝治疗提供了全新的解决方案。相关研究成果以“Leech bionic Hirudin fusion protein prodrug loaded microneedles for long-term inhibition of thrombosis”为题于药学领域国际著名期刊Journal of Controlled Release（中科院一区Top，IF=10.5）在线发表。

血栓形成是心脑血管疾病的重要致病因素。抗凝药物作为第一道防线，在临床上广泛用于血栓性疾病的治疗和预防。水蛭素是一种天然凝血酶抑制剂。与肝素相比，水蛭素不与血小板相互作用，不会诱导血小板减少症。然而，水蛭素及其衍生物的半衰期短，需要频繁注射，导致患者依从性差和感染风险的增加。因此，水蛭素长效制剂亟待开发。

本研究制备了一种水蛭仿生微针贴片，具有无痛给药和按需恢复生物活性的特点，实现安全长效抗血栓治疗（图1）。水蛭的嘴里有许多锋利的“小牙齿”，对宿主造成的创伤很小。通过分泌含有水蛭素的唾液，可有效抑制受损血管中血栓的形成。微针贴片模拟水蛭牙齿刺穿皮肤表面并以微创方式递送水蛭素融合蛋白。重组水蛭素及其衍生物，包括来匹卢定、地西鲁定和比伐卢定，已获得美国食品药品监督管理局的批准。目前临床应用的抗凝药物重组水蛭素可通过基因工程技术实现规模化生产。这为水蛭素融合蛋白的合成提供了一个精准高效的生物合成平台。本研究将水蛭素融合蛋白与微针透皮递送技术相结合，开发了一种兼具长效性和安全性的抗血栓治疗方案。本研究通过基因工程技术构建了cfEH的融合蛋白前药（具有血栓靶向和FXa响应特性的ELP-HV融合蛋白）。cfEH由四个部分构成：i) 重组水蛭素变体1 （HV），ii) 长效融合伴侣类弹性蛋白样多肽（ELP），iii) FXa响应性四肽基序IEGR，作为连接HV和ELP的“桥梁”，并能特异性响应FXa。iv)血栓靶向基序CREKA，该肽对血管中凝固的血浆纤维蛋白具有极强的亲和力。将cfEH/MN微针贴片应用于皮肤上，“前药”cfEH融合蛋白从微针中持续释放到体内，血栓靶向基序CREKA会引导cfEH聚集到血栓发生部位。在血栓发生处，高浓度FXa会识别并降解IEGR序列，释放出具有活性的HV，从而发挥高效的抗凝作用。此外，由丝素蛋白和壳聚糖制备微针贴片可实现cfEH长达一周的持续释放。与载有游离HV的HV/MN贴片相比，低载药量的cfEH/MN贴片具有优异的药代动力学行为。在多种动物血栓模型中，cfEH/MN贴片可以实现在一周内有效抑制血栓形成，并降低出血风险。该研究为血栓栓塞类疾病的预防和治疗提供了新策略。

图1. 水蛭仿生微针贴片（cfEH/MN）用于长效抗凝治疗示意图。A）基于基因工程技术构建的融合蛋白前药cfEH，并封装于微针贴片中；B）微针贴片经皮给药实现cfEH的持续释放；C）融合蛋白胶束（i）针对血栓形成的凝块靶向积累和（ii）FXa响应性生物活性恢复。

通过基因工程技术，以FXa响应性基序IEGR为连接片段，将不同长度（40 、60 和80 个重复单元）的弹性蛋白样多肽（ELP）与水蛭素（HV）相连接，并在HV的C端引入五肽CRKEA用于靶向血栓。由此获得的兼具血栓靶向性和FXa响应能力的ELP-HV融合蛋白，命名为cfEHs。经过大肠杆菌表达和反向过渡循环（ITC）纯化，获得三种融合蛋白（图2）。通过测量浊度与温度的关系，获得cfE40H、cfE60H和cfE80H的相变温度，60 个重复单元的ELP可驱动融合蛋白在体温下自组装为高度有序的胶束。考虑到cfE80H可能因在体温下强烈聚集而堵塞血管，在后续研究中选择60 个重复单元的ELP作为融合蛋白的融合伴侣。并通过凝血酶滴定实验测定cfE60H抗凝活性，HV的N端修饰能够屏蔽其抗凝活性，当cfE60H与FXa孵育后，FXa响应基序被切割后释放出HV，融合蛋白的抗凝活性逐渐恢复。全血孵育实验显示cfE60H具有较强的抗凝活性。

图2. cfEHs的体外特性分析。A)纯化后的cfE40H、cfE60H和cfE80H的SDS-PAGE分析。B)浓度为20 μM的cfE40H、cfE60H和 cfE80H 在15 ℃和37 ℃的照片。C)浓度为20 μM的cfE40H、cfE60H和cfE80H的浊度随时间变化。D) cfE40H和cfE60H在15 ℃和37 ℃的动态光散射（DLS）分析。E) cfE40H、cfE60H和cfE80H在37 ℃的结构示意图。F) cfE60H和cnE60H的生物活性分析（n=3）。G) cfE60H与FXa在37 ℃孵育前后的透射电镜（TEM）图像，比例尺：100 nm。H) 生理盐水、HV 或 cfE60H 与全血孵育2 小时的照片。

贴片的针尖由丝素蛋白（SF）和壳聚糖（CS）基质构成，基底由聚丙烯酸（PAA）制成。微针贴片的针为圆锥形，高度约600 μm，直径约300 μm。在9×9 cm2的贴片上，微针呈10×10阵列分布（图3）。微针贴片的针尖必须具备足够的机械强度以确保针尖能穿透皮肤到达真皮层，机械强度测试表明cfEH/MN贴片完全具备穿刺皮肤的能力。体外释放研究表明cfEH自组装成胶束可减少微针贴片中药物的突释现象，释放出的cfEH仍保持自组装能力和抗凝活性。储存稳定性实验显示，微针贴片在4℃和25℃干燥条件下存放4 周后，与新制备的微针贴片相比无显著性差异。

图3.cfEH/MN贴片的体外特性分析。A) cfEH/MN贴片制备流程示意图。(i) 含cfEH、甲基丙烯酸酯修饰丝素蛋白（SF-MA）、甲基丙烯酸酯修饰壳聚糖（CS-MA）及光引发剂的溶液滴加到微针模具中；(ii) 真空处理；(iii) 滴加聚丙烯酸（PAA）溶液；(iv) 干燥；(v) 光交联固化。B) 不同图案微针的光学照片。C) cfEH/MN的光学图像。D) 微针（MN）与cfEH/MN的机械抗压测试。E) 罗丹明标记HV/MN（Rho-HV/MN和罗丹明标记cfEH/MN（Rho-cfEH/MN）的体外累积释药曲线（n=3）。F)从微针中释放的cfEH在37℃透射电镜（TEM）图像，比例尺：100 nm。G) 从微针中释放的cfEH抗凝活性分析（n=3）。

Cy5.5标记cfEH（Cy5.5-cfEH/MN）的微针贴片贴于小鼠皮肤上，通过活体成像系统（IVIS）检测其长效滞留时间，Cy5.5-cfEH/MN 组的整体信号强度始终强于Cy5.5-HV/MN组（图4），推测是由于纳米组装体的形成延长了Cy5.5-cfEH从微针中的释放时间。通过静脉注射Rho-cfEH和Rho-HV溶液评估药代动力学特征，与Rho-HV相比，Rho-cfEH的循环时间显著延长。进一步，将装载高剂量和低剂量cfEH的Rho-cfEH/MN贴片贴于小鼠皮肤。结果显示，与游离HV相比，cfEH装载到微针中可实现更平缓、持续的释放，并且低剂量cfEH/MN可实现长效的抗凝作用。

图4.cfEH/MN的体内滞留性与药代动力学。A) Cy5.5-HV/MN和Cy5.5-cfEH/MN贴片处理的小鼠荧光成像。B) Cy5.5-cfEH/MN贴片处理后第1 、2 、7 天小鼠不同组织的离体荧光成像。C) 荧光定量分析。D) Rho-HV和 Rho-cfEH静脉注射后的血浆浓度—时间曲线（n=3）。E) 高剂量或低剂量Rho-HV/MN和Rho-cfEH/MN的血浆浓度—时间曲线。F) 曲线下面积（AUC）分析（n=3）。

五肽基序CREAK的融合用于提高融合蛋白cfEH的血栓靶向能力，在凝血激酶诱导的肺栓塞模型和FeCl₃诱导的颈动脉血栓模型中证明cfEH/MN的体内靶向能力（图5）。通过共聚焦显微镜观察肺组织的荧光分布。罗丹明（Rho-fibrinogen）标记纤维蛋白原，异硫氰酸荧光素（FITC-cnEH）标记cnEH。实验结果显示FITC-cnEH/MN组大部分FITC信号与Rho信号重叠，而FITC-nEH/MN组共定位程度较低，表明FITC-cnEH可以在凝块靶向基序的帮助下靶向血栓部位。同时通过6 % FeCl3溶液诱导颈动脉血栓模型验证cnEH/MN的血栓靶向能力。通过荧光显微镜监测Rho 6G的荧光分布以确定栓塞水平。血血栓部位中cnEH的含量逐渐增加，定量数据显示FITC-cnEH/MN的血栓靶向性是FITC-nEH/MN的2 倍。

图5. 体外与体内血栓靶向研究。A) 生理盐水、Cy7-cnEH 或 Cy7-nEH 孵育后的体外血栓荧光图像。B)血栓荧光强度的定量分析（n=3）。C) 给予Cy7-cnEH/MN或Cy7-nEH/MN后，小鼠肺栓塞的荧光图像。D) 肺栓塞荧光强度的定量分析。E) FITC-cnEH/MN或 FITC-nEH/MN处理后Rho荧光强度变化的定量分析（n=3）。F) 肺栓塞小鼠肺切片的荧光图像（比例尺:100 μm）。G) FeCl₃诱导的血栓模型小鼠经FITC-cnEH/MN或FITC-nEH/MN处理后的实时荧光图像（比例尺：500 μm）。

图6. 凝血激酶诱导肺栓塞模型的体内抗血栓活性。A) 不同处理后小鼠肺栓塞的代表性荧光图像。B)肺栓塞荧光强度的定量分析。C)不同处理后肺栓塞小鼠肺切片的H&和Masson染色结果（比例尺：100 μm）。D)相对血栓面积。E)不同处理后第7 天给予凝血激酶刺激的小鼠生存曲线（n=6）。F) cfEH/MN贴片应用后第7天，单次或连续凝血活酶诱导的小鼠的肺切片相对凝块面积。

通过构建凝血激酶诱导的肺栓塞模型验证cfEH/MN的体内抗血栓活性（图6 ）。在血栓诱导前6 h、3 d和7 d对小鼠进行不同给药处理：1 ）空白MN; 2）cfEH溶液（sc）; 3）fEH/MN; 4）cfEH/MN。每只小鼠静脉注射Cy5.5标记的纤维蛋白原和凝血活酶。血栓诱导20 min后，对小鼠实施安乐死，并对肺部进行取样，通过IVIS检测Cy5.5标记血栓的荧光强度。实验结果显示cfEH/MN在7 天内有效抑制血栓形成，并且优于没有靶向配体修饰的fEH/MN组，由于MN持续释放cfEH，在靶向配体的帮助下，cfEH有效地集中在血栓形成部位，抑制血栓形成。组织学检查证实，cfEH/MN组小鼠肺组织观察到的血栓几乎可以忽略不计。经肺栓塞诱导后，接受cfEH/MN和fEH/MN治疗的组小鼠均存活下来。

图7.FeCl₃诱导颈动脉血栓模型的体内抗血栓效应。A) 不同处理后小鼠颈动脉的代表性荧光图像（比例尺：500 μm）。B) 不同处理后小鼠颈动脉的H&E染色结果（比例尺：100 μm）。C) 栓塞率定量分析。D) 连续诱导血栓后，cfEH/MN贴片处理不同时间的小鼠颈动脉代表性荧光图像（比例尺：500 μm）。E) cfEH/MN 或空白MN处理后，连续诱导血栓时颈动脉的相对Rho荧光强度（n=3）。

进一步评估了cfEH/MN贴片在FeCl3诱导的小鼠颈动脉血栓模型中的治疗效果（图7 ）。结果显示在各个时间点cfEH/MN组血管中Rho荧光强度较低，表明cfEH/MN对颈动脉栓塞具有显著而持久的抑制作用。定量结果显示，空白MN处理小鼠血管栓塞率在所有时间点均高于95%。而cfEH/MN治疗组的栓塞率较低，为 7.7 %（6 h）、 8.0 %（3 d）和19.7 %（7 d）。

综上，本研究开发了一种长效且安全的抗凝cfEH/MN贴片。通过基因工程技术，将水蛭素、长效伴侣ELP、FXa反应基序和血栓靶向配体整合，通过大肠杆菌表达系统获得可组装的融合蛋白前药cfEH ，并将融合蛋白进一步加载到由丝素蛋白和壳聚糖制成的MN基质中，最终制备出长效抗凝贴片。将贴片应用于皮肤上，cfEH胶束从微针贴片中持续释放并在血液中循环。在FXa水解的作用下，融合蛋白前药恢复抗凝活性从而抑制血栓形成。在小鼠颈动脉血栓模型和肺栓塞模型中证明了cfEH/MN贴片长效抗凝活性。安全实验表明，cfEH/MN贴片可以最大限度地减少出血副作用，并且不会引起主要器官的病变。本研究开发的长效抗凝贴片为抗血栓治疗提供了一个新思路。

该论文第一作者是药学院田雪老师，高兵兵副教授和姜天玥教授是论文通讯作者。该工作受到国家重点研发计划、国家自然科学基金、药学院学科基金等项目的支持。