CellStemCell丨陈迪/黄慧琳/梁洪青合作揭示m6A修饰通过负向调控方式抑制体细胞向生殖细胞转化及其机制

摘要：深入研究生殖细胞的起源与分化机制是理解生育力的关键。原始生殖细胞（ Primordial Germ Cell ,PGC）作为生殖细胞的前体，其在发育过程中所累积的遗传或表观遗传异常，可能导致配子形成障碍，从而影响生育力的建立与维持。研究原始生殖细胞的发

深入研究生殖细胞的起源与分化机制是理解生育力的关键。原始生殖细胞（ Primordial Germ Cell ,PGC）作为生殖细胞的前体，其在发育过程中所累积的遗传或表观遗传异常，可能导致配子形成障碍，从而影响生育力的建立与维持。研究原始生殖细胞的发育机制不仅帮助我们更深入地理解人生殖系统建立的生物学过程，还为开发新的辅助生殖技术提供关键依据。

近年来的大量研究表明，表观转录组修饰，尤其是 RNA 的 N 6 - 甲基腺苷（ m 6 A ）修饰，在生殖细胞的发生和发展中发挥关键作用。在体内， m 6 A 修饰主要受三类蛋白调节。“编码器”蛋白（ writer ， m 6 A 甲基化转移酶）将甲基基团转移到 RNA 上；“消码器”蛋白（ eraser ， m 6 A 去甲基化酶）去除在 RNA 上的甲基化；“读码器”蛋白（ reader ， m 6 A 结合蛋白和 m 6 A 识别蛋白）识别 RNA 上的 m 6 A 修饰并且介导下游功能性反应。因此， RNA 上的 m 6 A 甲基化修饰是一个可逆的动态过程，分别由编码器写入和消码器去除，并且通过读码器识别，影响不同生物学过程，最终参与细胞命运决定，包括生殖细胞发育的各个阶段。

2025 年 5 月 27 日，浙江大学爱丁堡大学联合学院陈迪团队、中山大学肿瘤防治中心黄慧琳团队及浙江大学医学院梁洪青团队合作，在Cell Stem Cell上发表了题为：IGF2BP1 restricts the induction of human primordial germ cell fate in an m6A-dependent manner的研究论文。该研究借助三维诱导分化体系，先将hESC诱导成为中间状态的细胞，进而运用类器官三维培养的方式诱导出hPGC样细胞（ hPGC -like cell ， hPGCLC ）。该研究发现，m6A修饰通过负向调控方式抑制体细胞向生殖细胞转化并发现了一条限制人类生殖细胞特化的关键通路——m6A-IGF2BP1-OTX2-MacroH2A.1-TFAP2C调控轴。

由于人胚胎干细胞具有分化成为体内各种细胞命运的潜能，包括生殖细胞。研究人员首先对人胚胎干细胞（ human embryonic stem cell ， hESC ）的 m 6 A 测序分析，鉴定出 m 6 A 修饰 mRNA 显著富集在生殖系统发育和胚胎发育相关的基因，提示了 m 6 A 修饰可能参与生殖细胞发生发育的重要过程。虽然编码器蛋白和消码器蛋白决定了特定细胞里的 m 6 A 修饰谱，但是 m 6 A 修饰如何调控 RNA 命运从而参与调控细胞命运取决于读码器蛋白。研究人员借助基因敲降技术对 hESC 中 m 6 A 读码器蛋白分别敲降后并诱导为 hPGCLC ，发现仅 IGF2BP1 被敲降后会导致 hPGCLC 数量显著增多。研究人员为了验证这一表型，利用 CRISPR-Cas9 技术构建了 IGF2BP1 敲除 hESC 并将其诱导为 hPGCLC ，结果证实了 IGF2BP1 缺失后会导致 hPGCLC 数量变多。

此外，研究人员发现 m 6 A 编码器蛋白 METTL3 和 METTL14 缺失或 m 6 A 擦除器蛋白 ALKBH5 和 FTO 过表达均会导致 hPGCLC 比例显著增多，其表型与 IGF2BP1 敲除保持一致。以上结果表明 m 6 A 修饰介导的表观调控限制 hPGCLC 发生发育过程。

为了深入探索 m 6 A 修饰和 IGF2BP1 限制 hPGC 发生发育的分子机制，研究人员结合 m 6 A 修饰的 RNAs 、 IGF2BP1 所结合的 RNAs 、 IGF2BP1 敲除后下调基因的数据，交叉比对后筛选出 7 个可能下游因子。然后利用基因敲降技术和三维诱导分化体系，对下游基因进行筛选，发现只有 OTX2 被敲降后，会使 hPGCLC 比例显著增多，其表型与 m 6 A 修饰缺失和 IGF2BP1 敲除保持一致。此外，研究人员在 IGF2BP1 敲除细胞中回补 OTX2 ，发现过表达 OTX2 能挽救 IGF2BP1 敲除的表型，提示了 IGF2BP1 通过调控 OTX2 的表达从而抑制了 hPGC 发生发育。

为了深入探究转录因子 O TX2 如何限制 hPGC 发生发育，研究人员结合 RNA 测序和靶向切割和标签化技术数据分析，对 OTX2 敲除细胞和 OTX2 过表达细胞进行全面分析。结果表明， OTX2 并非直接在转录层面上调控基因表达。研究人员通过免疫沉淀质谱联用技术分析 OTX2 相互作用的蛋白组，发现 hPGC 正向调控因子 TFAP2C 与 OTX2 具有相互作用。研究人员利用了双荧光素酶报告实验检测 hPGC 关键因子 SOX17 介导的荧光素酶活性，发现单独 TFAP2C 表达促进 SOX17 介导的萤光素酶活性， TFAP2C 和 OTX2 共表达则抑制 SOX17 介导的萤光素酶活性，提示 OTX2 可能抑制 TFAP2C ，从而限制了 hPGC 发生发育。为了验证 TFAP2C 是 OTX2 的下游因子，研究人员将 OTX2 单敲除、 TFAP2C 单敲除和 OTX2/TFAP2C 双敲除 hESC 诱导为 hPGCLC 。结果表明，与对照组相比， OTX2 单敲除 hPGCLC 比例显著增多，而 TFAP2C 单敲除和 OTX2/TFAP2C 双敲除 hPGCLC 比例显著减少，支持 OTX2 通过抑制 TFAP2C 的功能，从而限制 hPGCLC 发生发育的结论。

为了进一步探究 OTX2 在 hPGC 发生发育中如何抑制 TFAP2C 的功能，研究人员利用免疫沉淀质谱联用技术，捕获对照组和 OTX2 单敲除细胞中 TFAP2C 相互作用蛋白组。通过与 OTX2 相互作用蛋白组数据、免疫荧光技术、基因敲降技术和三维诱导分化体系整合分析。研究人员发现，在生理状态下， MacroH2A.1 、 TFAP2C 和 OTX2 三者形成稳定的蛋白互作复合物，当 OTX2 缺失后， MacroH2A.1 与 TFAP2C 的相互作用显著减弱，并且 MacroH2A.1 敲低 hESC 诱导为 hPGCLC ，其 hPGCLC 比例显著增多，与 OTX2 敲除结果保持一致。该结果表明， MacroH2A.1 是介导 OTX2 抑制 TFAP2C 的关键下游因子。