Nature丨染色体末端保护：RAP1介导的DNA-PK抑制机制

摘要：端粒是位于染色体末端的特殊核蛋白复合体，其核心功能是保护染色体末端不被识别为DNA双链断裂（DSB），从而防止有害的DNA损伤反应激活。在哺乳动物细胞中，这一保护作用主要由shelterin复合体介导，该复合体包含TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP

撰文 | 易

端粒是位于染色体末端的特殊核蛋白复合体，其核心功能是保护染色体末端不被识别为DNA双链断裂（DSB），从而防止有害的DNA损伤反应激活。在哺乳动物细胞中，这一保护作用主要由shelterin复合体介导，该复合体包含TRF1、TRF2、RAP1、TIN2、TPP1和POT1六个亚基。其中，TRF2被认为通过促进端粒DNA形成t-loop结构（一种套索状构象）来物理性隐藏染色体末端，使其不被DNA损伤修复机器识别。然而，t-loop的组装依赖于端粒3'单链悬垂的存在，而DNA复制过程中前导链合成的端粒是平末端的，需要通过5'端切除来生成3'悬垂，这一切除过程由Apollo核酸外切酶介导，且需要DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK，非同源末端连接cNHEJ途径的核心激酶）的参与。在经典非同源末端连接（cNHEJ）过程中，DNA-PK会包裹游离DNA末端，形成包括连接酶4（LIG4）在内的下游末端连接因子的招募平台。

这一发现提出了一个关键矛盾：DNA-PK作为cNHEJ的核心组分，也能结合端粒并调控其末端切除，为何在参与端粒切除的同时不会激活有害的末端连接？此外，在酵母中，Rap1蛋白被证明可以直接结合端粒DNA并抑制cNHEJ，但哺乳动物RAP1不直接结合DNA，而是通过TRF2招募到端粒，其功能一直不甚明确。

近日，英国癌症研究所Max E. Douglas和瑞典林雪平大学Francisca Lottersberger联合在Nature期刊上发表题为Chromosome end protection by RAP1-mediated inhibition of DNA-PK的研究论文，揭示了端粒保护的一种新机制：shelterin复合体的TRF2和RAP1蛋白通过与DNA-PK形成抑制性复合物，直接阻断其招募连接酶LIG4的能力，从而在端粒处特异性抑制非同源末端连接（cNHEJ），与Apollo核酸酶介导的3'悬垂机制共同确保染色体末端的稳定性。

作者首先构建了多种基因编辑的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）模型，包括Apollo单敲除（Apollo-/-）、Rap1单敲除（Rap1-/-）以及双敲除（Apollo-/-Rap1-/-）细胞系，通过端粒荧光原位杂交（FISH）技术定量分析不同基因型细胞中染色体融合的频率，并利用LIG4（cNHEJ必需连接酶）敲除细胞验证融合事件的机制依赖性，发现在Apollo-/-Rap1-/-双敲除MEFs中，约15%的端粒发生了LIG4依赖性的染色体型融合，而单敲除细胞未出现这一表型。在人RPE-1细胞中，APOLLO-/-RAP1-/-双敲除导致20-30%的端粒融合，且这些融合端粒均来源于前导链复制的染色体末端。这些结果证明哺乳动物端粒通过两条独立途径抑制cNHEJ：一条是Apollo依赖的3'悬垂途径，另一条是RAP1介导的独立于悬垂的保护机制。这些证据直接揭示了RAP1在端粒保护中的关键作用。

冷冻电镜结构显示，RAP1通过其Myb结构域插入端粒DNA的大沟，与KU70的SAP结构域形成协同结合；同时，RAP1的BRCT结构域精确占据了KU70/KU80表面的酸性区——这正是LIG4的结合位点。这种独特的空间排布产生了“分子刹车”效应：当RAP1与DNA-PK结合时，其BRCT结构域通过空间位阻直接阻断LIG4的招募，从而抑制cNHEJ的完成。这一机制得到系列突变实验的支持：破坏RAP1-KU相互作用的突变均导致LIG4重新招募和端粒融合；同样，破坏Myb-DNA相互作用的RAP1(R133E)突变体也丧失了保护功能。

系统发育分析表明RAP1-KU相互作用在进化上高度保守，可能早于Apollo在端粒功能中的特化。这一古老的保护机制在哺乳动物中继续发挥重要作用，特别是在端粒缩短的衰老细胞或复制压力条件下，当t-loop结构不稳定或Apollo介导的切除受阻时，RAP1通路可提供关键的保护作用。研究还发现，仅需少量端粒重复序列即可支持TRF2-RAP1的抑制功能，这解释了该机制如何保护严重缩短的端粒免于cNHEJ。这些发现不仅解决了“DNA-PK参与端粒代谢但抑制cNHEJ”的长期悖论，也为理解端粒相关疾病（如早衰综合征）的发病机制提供了新视角。

综上所述，端粒保护蛋白复合体shelterin的RAP1和TRF2组分能与DNA-PK形成复合物，直接抑制其在端粒处的末端连接功能。当RAP1与TRF2结合时，会与KU蛋白及DNA建立相互作用网络，从而阻止DNA-PK招募LIG4。在小鼠和人类细胞中，RAP1与Apollo核酸酶在抑制染色体末端cNHEJ方面具有功能冗余性，表明DNA-PK的抑制作用与悬垂依赖性机制并行不悖地防止端粒融合。本研究证实，DNA-PK的末端连接功能在端粒处被直接且特异地抑制，这为解释哺乳动物细胞如何维持单个线性染色体的稳定性提供了分子机制。

制版人：十一

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