摘要：今天来给大家讲讲2020 年 Scripps 研究所的 Wu Peng 等人在 Cell 上发表的一篇超厉害的文章！他们搞出了个超有创意的 (GDP - 岩藻糖 - 岩藻糖基转移酶) GDP-Fuc-FT 缀合物，这玩意儿可牛啦，能自己给自己 “加戏”，把岩藻

原创：Bicycle 来源：细胞基因研究圈

今天来给大家讲讲2020 年 Scripps 研究所的 Wu Peng 等人在 Cell 上发表的一篇超厉害的文章！他们搞出了个超有创意的 (GDP - 岩藻糖 - 岩藻糖基转移酶) GDP-Fuc-FT 缀合物，这玩意儿可牛啦，能自己给自己 “加戏”，把岩藻糖基转移酶装到细胞表面 ，就像给细胞贴上了一个神奇的 “小标签”，用来探测细胞和细胞之间的互动，更绝的是，还能精准找到肿瘤抗原特异性 T 细胞，简直是细胞界的 “火眼金睛”！

全文速览：肿瘤特异性抗原反应性 T 细胞（TSA-reactive T cells）在免疫检查点抑制疗法和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）为基础的细胞治疗里，那可是妥妥的 C 位担当。但尴尬的是，由于 TSA 反应性 T 细胞太 “调皮”，有着各种各样的特性，目前还没有一个靠谱的 “身份牌” 能专门把它们这群细胞给认出来。这篇文章就搞出了个 FucoID（Fucosyl-Biotinylation），这可是检测内源性抗原特异性 T 细胞的 “万能小助手”。它用了一种特别的糖基化标记方法，就像给 TSA 反应性 T 细胞穿上了一件独特的 “花衣裳”，只有它们能穿上，这样就能把它们和其他 “打酱油” 的旁观者 T 细胞区分开来，成功 “揪” 出它们啦。FucoID 可厉害啦，能在肿瘤里找到 TSA 反应性 CD4+、CD8+ T 细胞，还有 TSA 抑制性 CD4+ T 细胞，并且把它们和那些在旁边 “看热闹” 的旁观者 T 细胞分清楚。研究还发现，和那些旁观者 TIL 比起来，TSA 反应性 T 细胞有着不一样的 T 细胞受体（TCR）库，还有自己独特的 “基因密码”。另外，虽然 TSA 反应性 CD8+ TIL 看起来有点 “功能失调”，像是没睡醒的样子，但人家可是深藏不露，有着超强的增殖能力和肿瘤特异性杀伤能力，妥妥的 “扮猪吃老虎”！

全文详解

背景 & 设计：在过去十年里，免疫检查点抑制剂和基于细胞转移（ACT）疗法就像两个 “超级英雄”，给癌症治疗带来了大变革。但可惜的是，这两个 “英雄” 的威力有限，只对少数患者和癌症类型起作用。要想成功发起抗肿瘤免疫反应，就全靠肿瘤特异性抗原（TSA）反应性 T 细胞 “重振旗鼓”，重新激活和大量繁殖啦。但肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）太 “复杂多变”，导致患者对免疫疗法的反应也捉摸不定。TILs 里可不只有对 TSA 有反应的 T 细胞，还有一群识别非肿瘤抗原的旁观者 T 细胞在 “捣乱”。所以，找出 TSA 反应性 T 细胞对预测和治疗那可是至关重要。虽然可以通过检测表面标记物（比如 PD-1）从肿瘤消化物里大概富集出肿瘤反应性 T 细胞，但那些 “狡猾” 的旁观者 T 细胞也可能会 “冒充”，表达同样的标记物。传统方法通过反向免疫学和全外显子测序（WES）来找 TSA，然后再用计算工具预测 T 细胞反应性。这一套操作下来，不仅耗时久，而且准确性也不咋地。不过别怕，本文作者开发出了 FucoID 方法，不用提前知道 TSA 是啥，就能把抗原特异性 T 细胞给找出来。这个方法靠着肿瘤相关的 DC 细胞引导细胞间相互作用，用糖基化标记，也就是岩藻糖基化 - 生物素，给 TSA 反应性 T 细胞做上标记，然后就能把它们从旁观者 T 细胞里 “拎” 出来啦。想知道作者具体是怎么做到这么巧妙的操作吗？接着往下看！

研究内容：看下面这个图 A，作者之前开发的化学酶法可神奇了，能把重组蛋白 “粘” 到细胞表面。这个方法用了 α(1,3) FT，就像一个 “快递员”，能快速又准确地把蛋白从它的天然供体底物 GDP - 岩藻糖（GDP - Fuc）送到细胞表面的 LacNAc（或者唾液酸化 LacNAc）上（推荐阅读：NK 细胞搭载追踪器精准查杀肿瘤！—— 一步化学酶法构建 Antibody−Cell Conjugates）。因为 LacNAc 和唾液酸化 LacNAc 在好多细胞表面都有，像树突状细胞（DCs）和 T 细胞，所以这个方法就能用来给免疫细胞的表面 “改装” 啦。基于这个技术，作者就想着把 FT 弄到细胞表面，用这个 “固定在细胞膜上的小侦探” FT 来探测细胞和细胞之间的互动，看下面这个图 B。

首先，他们合成了一个小分子 - 蛋白缀合物，叫 GDP - 岩藻糖 - FT（GDP - Fuc - FT），这东西可有意思了，同时带着供体底物和糖基转移酶，就像一个 “多功能小包裹”。研究者把目标细胞和这个 GDP - Fuc - FT 放在一起 “培养感情”，这个酶就开始自己 “干活”，把 Fuc - FT 转移到细胞表面被 LacNAc 修饰的糖链上。

接着，作者就想验证一下 FT 功能化的细胞能不能通过 “亲密接触”，把标记物（比如岩藻糖 - 生物素，Fuc - Bio）转移到和它接触的细胞上，看下面这个图。在实验里，作者把 FT 功能化的 CHO 细胞和野生型 CHO 细胞放在一起培养，还加了 GDP - Fuc - Bio 来做标记。用荧光显微镜一看，哇塞，和 FT 功能化的 CHO 细胞 “贴贴” 的 CHO 细胞在接触的地方出现了超强烈的标记，而那些没 “贴贴” 的 CHO 细胞就干干净净，一点标记都没有。这就说明 FT 在细胞之间接触的时候真的能把标记物送过去，而且只给 “贴贴” 的细胞做标记哦。

然后，他们就用 FucoID 技术来看看抗原特异性的树突状细胞（DC）和 T 细胞之间是怎么 “互动” 的。

首先，研究者把 FT 修饰的不成熟树突状细胞（iDCs）和来自 OT - I 转基因小鼠的 CD8+ T 细胞放在一起培养，看上面这个图，这些小鼠的 TCR 能专门识别 OVA 肽段 OVA257–264。然后把 iDCs 用 OVA 肽段 OVA257–264 激活，再和 OT - I CD8+ T 细胞一起培养，还加了 GDP - 岩藻糖 - 生物素（GDP - Fuc - Bio）来做标记。实验结果显示，和 iDCs “对上眼” 结合在一起的 OT - I CD8+ T 细胞被标记得超明显，而那些没 “互动” 的细胞就只有很低的背景标记，看下面这个图。而且，用 LCMV GP33–41 肽段处理的 iDCs 就只引发了很低的背景标记，这就说明 FucoID 的标记是有抗原特异性的，可不是随便乱标记哦。

接着，作者又进一步验证了 FucoID 在更复杂的细胞 “大杂烩” 里对抗原特异性标记的本事。他们把用 OVA257–264 和 LCMV GP33–41 分别激活的 iDCs 和 OT - I、P14 CD8+ T 细胞混在一起培养，看下面这个图。结果发现，iDCs 很厉害地根据抗原特异性把 OT - I 和 P14 CD8+ T 细胞都标记好了，这就说明 FucoID 的敏感性和特异性都超棒！

最后，作者在 B16 - OVA 黑色素瘤模型里测试这个 FucoID 技术。把 B16 - OVA 肿瘤 “打散” 做成单细胞悬液，然后和用 B16 - OVA 肿瘤裂解物激活的 iDC - FT 放在一起培养，看下面这个图。

加了 GDP - Fuc - Bio 之后，iDC - FT 能把 57% 的 CD8+ TILs 都标记上。而没激活的 iDC - FT 就只能标记极少量的 CD8+ TILs（不到 2%）。另外，76% 的 CD8+ TILs 都表达 PD - 1，其中 74% 都被 iDC - FT 标记了，这就说明这部分细胞很可能就是 TSA 反应的 T 细胞。没被标记的 PD - 1+ TILs 可能就是那些 “打酱油” 的旁观者细胞。PD - 1 阴性 T 细胞里只有大概 3% 被标记，这就意味着几乎所有 TSA 反应的 T 细胞都已经和它们对应的抗原 “见过面” 啦，看下面这个图。

为了看看不同亚群在 OVA 刺激下能不能重新 “壮大队伍”，形成记忆，作者还把这些 TILs 分别转移到没有抗原的 C57BL/6J 小鼠身体里。过了一天，就给这些 “二次宿主” 小鼠用表达 OVA 的单核细胞增生性李斯特菌（LM - OVA）进行免疫。到第 8 天的时候，在血液里就能看到 PD - 1+Bio + 细胞大量增加，而 PD - 1+Bio–和 PD - 1–细胞就增加得很少。到第 38 天，在脾脏里还能检测到大概 0.2% 的 PD - 1+Bio+ T 细胞，而且大部分都是四聚体阳性细胞。进一步实验表明，这些转移的 T 细胞在再次遇到抗原的时候还能再一次大量繁殖，这就证明了它们有着抗原特异性记忆功能。

总结展望：肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）里可不单纯，不仅有针对肿瘤抗原的 T 细胞，还有一群识别其他和癌症没啥关系的表位（比如病毒抗原）的旁观者 CD8+ TILs 在里面 “凑热闹”。这些旁观者细胞在外表上和肿瘤抗原特异性 T 细胞有点像，但它们对肿瘤可不 “感冒”。FucoID 方法就像一个 “公平公正的裁判”，通过直接的 TCR - pMHC 相互作用生成选择标记（比如生物素），提供了一种不偏不倚的 TSA 反应性 TIL 识别方法。通过这个方法，研究人员发现了一种新的旁观者 T 细胞亚群（PD - 1+Bio– TILs），它们的转录组特征和之前报道的旁观者 PD - 1–CD8+ T 细胞可不一样。这就说明 FucoID 能找到一些传统方法（比如四聚体染色和功能标记）很难发现的细胞。

FucoID 的出现可帮了大忙了，研究人员能用它直接把 TSA 反应性 T 细胞 “收集” 起来，进行扩增，还能快速分离出相关的 TCR 来评估功能，这样就能大大缩短研究时间，降低成本。所以，作为第一种基于糖基转移酶开发的细胞间相互作用探针的方法，FucoID 不用进行复杂的基因操作，操作简单又方便，这就意味着它在临床环境里用来检测和分离人类 TSA 反应性 TILs 有着很大的潜力。它肯定能加快 TSA 反应性 TIL 及其 TCR 的发现，以后个性化癌症治疗的成本说不定就能降下来，更多患者也能受益啦！

来源：科学易点