登上《柳叶刀》子刊！迪谱诊断基于纳米孔宏基因组测序最新研究成果顺利发表

摘要：肺炎诊治的核心环节是病原学诊断。传统检测手段，如培养法，耗时长、阳性检出率低，且难以检测病毒与非典型病原体；而血清学方法、基因芯片和PCR技术仅能在极小范围内检出一种或数种病原，存在一定“盲区”。宏基因组二代测序（mNGS）虽能突破上述缺点，但其读长较短，不能

转自：迪安诊断

研究背景

肺炎诊治的核心环节是病原学诊断。传统检测手段，如培养法，耗时长、阳性检出率低，且难以检测病毒与非典型病原体；而血清学方法、基因芯片和PCR技术仅能在极小范围内检出一种或数种病原，存在一定“盲区”。宏基因组二代测序（mNGS）虽能突破上述缺点，但其读长较短，不能精准鉴定相似病原体，受限于成本较高、流程繁琐等因素，其本地化开展较为困难。

纳米孔测序技术凭借长读长、实时分析、便携灵活等优势，成为突破传统技术瓶颈的新方向之一。mTGS具有操作简便、灵活测序、分析简单等天然优势，可辅助临床进行快速病原诊断。但目前行业仍缺乏基于mTGS的技术要求和流程体系规范，使其临床应用受到局限。

研究方法

本研究在既往纳米孔宏基因流程体系（Pre-mTGS）的基础上，利用参考样本和8名来自肺炎患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）样本，通过改进关键流程参数（包括破壁条件、片段大小筛选、去人源条件和测序数据量等），优化形成标准化mTGS工作流程。

为了评估优化后的mTGS的临床诊断价值，本研究纳入了一项多中心前瞻性队列研究，涉及313名疑似肺炎患者。每份BALF样本均经过传统微生物（CMTs）、mNGS、Pre-mTGS和标准化mTGS的检测流程，通过多种方法的综合全面分析，评估mTGS在肺炎患者肺泡灌洗液检测中的诊断价值。

研究结果

基于参考样本

对mTGS实验参数的优化

• 破壁条件：既往研究发现，结核、真菌等厚壁菌检出率普遍较低。因此我们优化了破壁处理中的相关条件：更换研磨设备、提高研磨速度、增加溶菌酶、调整裂解温度等，并评估破壁条件优化前、后（C001、C002）的检出性能。经测试，与C001相比，C002条件下结核分枝杆菌、新型隐球菌、酿酒酵母菌均可稳定检出，且检出病原reads数显著提高（P＜0.01）（图1a），其余10种病原体的检出情况，二者不具有统计学差异。

• 片段筛选条件：既往研究发现mTGS对病毒检出敏感性较低。我们优化了片段筛选中的相关条件：采用“末端+切口”双修复功能的修复酶、增加磁珠纯化比例等，并评估片筛条件优化前、后（R001、R002）的片段大小。经测试，R001条件下，参考品测序片段读长集中在200-300bp，而R002条件下测序reads读长明显增加，多集中在1000bp左右，且＞3Kb的长片段数明显增加（图1b）。

• 去人源条件及数据量确定：人源核酸占比严重影响宏基因组检测灵敏度，数据量的增加也会造成测序成本进一步增加。本研究设计了D001(不去人源)，D002(1:1去人源)，D003(1:4去人源)三组实验条件，并摸索各种条件下的mTGS的最佳测序数据量。经测试，D001、D002、D003条件下，各种病原微生物检出reads数目与测序数据量均呈线性增加关系，其中粪肠球菌、发酵乳杆菌、鸟分枝杆菌、铜绿假单胞菌的病原检出reads数随数据量增加幅度最为显著（图1c）。但基于检测性能、分析要求、测序成本及测序时间等多重因素考虑，800MB数据量可初步作为mTGS的最佳数据量，并在临床样本中进一步验证。

800MB数据量下，我们进一步评估D001、D002、D003条件对参考品中各病原微生物的检测影响。经测试，D003条件下各种病原微生物检出情况最好，其中单核细胞增多性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、新型隐球菌的检出reads数显著增加（P＜0.05），但所有13种病原微生物均可在3种条件下稳定检出（图1d）。

图1 不同实验条件下参考样本检测结果

汇总分析各种参数条件下参考品的总体结果可见：R002条件下，不同去人源程度对数据平均读长影响差异不显著，但D003处理下，测序片段的平均读长最为集中，片段分析效果最好（图1e）；1:4去人源处理条件下，与R001片筛条件相比，R002片筛处理下测序片段reads平均读长显著增加（图1b、图1e）。综合分析来看，我们把C002破壁条件、R002片筛处理、D001不去人源及800MB数据量，作为mTGS的反应体系条件，并进行临床样本进一步验证。

基于临床小量样本

对mTGS实验参数的优化

在临床预实验样本中，我们观察到，不同去人源处理和测序数据量对病原体检测性能影响差异显著。其中D001不去人源处理能明显提高病原微生物的检出，尤其是丰度较低的病原微生物，如结核分枝杆菌、鹦鹉热衣原体、耶氏肺孢子菌（图2a）。而在不同数据量下发现：耶氏肺孢子菌、白色念珠菌、巨细胞病毒等病原体在800MB数据量条件下检出reads数基本趋于稳定，进一步增加数据量时不会明显提升病原体检出reads数，故800MB数据量或可作为纳米孔mTGS检测临床样本的平台期（图2b），进一步增加数据量将使测序成本及测序时间进一步增加，不具有经济学价值。

图2 不同实验条件下预实验样本检测结果

优化前后Pre-mTGS、mTGS流程体系

及检测限对比

根据参考样本和预实验中临床小量样本的参数探索，我们确认临床样本中mTGS流程的最佳反应系统包括C002破壁处理、R002片筛处理、D001不去人源和800MB测序数据量。相比之下，没有进行任何优化的基本流程系统（Pre-mTGS）被用作对比研究。两种方法的实验工作流程见图3。

图3 优化前后Pre-mTGS、mTGS工作流程体系

使用参考样本分别对Pre-mTGS、mTGS的检测限进行验证。测试发现，mTGS较Pre-mTGS，在检出枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、新型隐球菌上，检测限由104 copies/mL提高至103 copies/mL，HPV检测限由105 copies/mL提高至104 copies/mL，检测灵敏度均提高10倍以上，而其他病原体的检测限二者保持一致（表1）。

表1 Pre-mTGS、mTGS的检测灵敏度

基于临床大量样本

对mTGS流程进行诊断性能评估

本研究纳入2023年6月-2025年3月间，来自7家医院的共计313例疑似肺炎患者，最终274例患者被临床明确诊断为肺部感染，所有274例肺炎感染患者共计检出376株病原微生物，CMTs、mNGS、Pre-mTGS和mTGS的检测性能被分别评估。

从检出物种数来看，与传统CMTs和Pre-mTGS相比，mTGS能识别的病原体范围更广(mTGS vs.CMTs vs.Pre-mTGS)：包括细菌(179vs.67vs.94)、真菌(93vs.37vs.43)、病毒(22vs.10vs.19)和其他类型病原体(20vs.1vs.4)，mTGS的总体病原检出物种与mNGS持相当水平（图4a）。

从检出责任病原体来看，mTGS方法较CMTs及Pre-mTGS方法，对责任病原体的整体检测性能有了显著改善，总体表现与mNGS持相当水平，但个别病原体检出二者各有优劣。其中mNGS在NTM、耶氏肺孢子菌和曲霉检出上灵敏度更高，而mTGS在MTB、鹦鹉热衣原体和肺炎链球菌检出上则更胜一筹（图4b）。

从临床诊断一致性来看，mTGS与最终临床诊断的总体一致性为81.80%，较CMTs和Pre-mTGS，分别提高了43.8%和35.80%，略优于mNGS的一致性表现，但二者不具有统计学意义(81.80% vs. 78.10%)（图4c）。

图4 四种方法下临床样本中病原微生物检测结果

综合来看，mTGS的检测灵敏度和阴性预测值（NPV）较CMTs和Pre-mTGS方法显著提升（84.70%vs.39.4%vs.52.19%；40.00%vs.17.80%vs.19.63%;）；与mNGS相比，mTGS表现出相似的灵敏度和阳性预测值（PPV）（84.70%vs.79.90%；95.5%vs.96.9%），mNGS表现出更高的特异性，mTGS则表现出更优越的NPV水平（表2）。