摘要：类黄酮（特别是花青素和儿茶素）与氨基酸是茶叶中富含健康促进代谢物的两大组分。尽管我们观察到紫色茶叶中脱落酸大量积累而在白化茶叶中含量极低，但其影响风味物质的具体机制尚不明确。本研究通过外源施加脱落酸及其生物合成抑制剂（氟啶酮，Flu）处理茶叶，测定生理指标并结

摘要：类黄酮（特别是花青素和儿茶素）与氨基酸是茶叶中富含健康促进代谢物的两大组分。尽管我们观察到紫色茶叶中脱落酸大量积累而在白化茶叶中含量极低，但其影响风味物质的具体机制尚不明确。本研究通过外源施加脱落酸及其生物合成抑制剂（氟啶酮，Flu）处理茶叶，测定生理指标并结合转录组与代谢组联合分析，系统解析了叶片色泽变化的潜在机制。结果表明：脱落酸处理诱导茶叶呈现紫色，而Flu处理则导致叶片褪色。代谢组分析显示脱落酸处理组中4种花青素和6种儿茶素含量显著高于对照组；Flu处理组中15种氨基酸含量显著上升。值得注意的是，两类代谢物在两种处理中呈现此消彼长的负相关关系。转录组分析表明，脱落酸处理组中编码二氢黄酮醇还原酶和尿苷二磷酸-葡萄糖苷类黄酮糖基转移酶的差异表达基因上调，促进特定花青素与儿茶素积累；而Flu处理组中编码硝酸还原酶和硝酸盐转运蛋白的差异表达基因表达增强，进而促进氨基酸（尤其是L-茶氨酸和L-谷氨酰胺）的积累。共表达网络分析进一步揭示，MYB和bHLH转录因子可能通过调控差异表达基因参与类黄酮和氨基酸的生物合成过程。本研究为通过靶向遗传工程手段提升茶叶营养与商业价值提供了理论依据，同时指出紫色与白化茶叶作为功能性饮料的应用潜力，为未来育种计划与生产实践提供了指导。

1 研究背景

茶树（Camellia sinensisL.）是一种多年生木本植物，以其丰富的次生代谢物而闻名。茶作为一种饮料作物广受欢迎，因为其具有特色成分，包括氨基酸、花青素和儿茶素，这些成分被认为具有多种有益功效。然而，绿叶品种中这些代谢物的含量有限。近年来，各国发现并培育了特殊的紫叶（如‘紫鹃’和‘紫福星’）和白化（如‘白鸡冠’和‘黄金芽’）茶树品种。与绿叶品种相比，紫叶茶树品种的类黄酮（如花青素和儿茶素）浓度显著更高。相比之下，白化茶树品种的芽中积累了更多的氨基酸和更少的类黄酮。这些代谢物的微妙平衡变化对茶叶的风味有深远影响。因此，由叶色变化引起的代谢物变化是一个备受关注的问题。

脱落酸（ABA）是一种调节次生代谢物的植物激素。它能刺激多种植物（包括茶树）中花青素的合成。脱落酸能够调节儿茶素的含量，并调控茶叶中苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸 4 - 羟化酶等生物合成基因的转录水平。研究人员通常利用脱落酸合成抑制剂来验证脱落酸在植物中的功能，这依赖于对脱落酸合成途径的解析。脱落酸来源于类胡萝卜素，类胡萝卜素在质体中合成和积累。类胡萝卜素的生成是一个代谢过程，需要通过八氢番茄红素合成酶（PSY）的作用，将两分子的香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）进行酶促转化，从而生物合成番茄红素、β- 胡萝卜素，进而合成 β- 叶黄素。β- 胡萝卜素在 β- 胡萝卜素羟化酶（βCHX）的作用下转化为 β- 隐黄质和玉米黄质。玉米黄质在玉米黄质环氧化酶（ZEP）的作用下进一步转化为紫黄质。紫黄质合成后，可转化为新黄质，并从质体输出到细胞质中。在细胞质中，它经过氧化产生脱落酸。氟啶酮（Flu）作为一种脱落酸合成抑制剂，通过抑制类胡萝卜素的合成来实现对脱落酸的抑制。在先前的一项研究中，研究人员使用氟啶酮抑制脱落酸的合成，以降低花青素水平。

类黄酮和氨基酸代谢的初始成分（苯丙氨酸和谷氨酸）都来源于糖酵解和三羧酸（TCA）循环的中间产物，如磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和 2 - 酮戊二酸。近年来，人们致力于解释茶叶颜色变化背后的代谢差异，特别是类黄酮和氨基酸的差异积累机制，旨在培育具有更高水平有益健康代谢物的改良茶树品种。本研究重点对‘紫娟’、‘紫妍’和‘金明早’的花青素进行提取和鉴定。研究结果表明，这些品种具有显著较高的抗氧化能力。转录组分析揭示了紫色茶中花青素代谢的调控机制，这种调控由 CHS、CHI、DFR、ANS 和 ABC 转运蛋白的丰度，以及 bHLH 和 MYB 的水平，还有苯丙氨酸的积累介导。推测关键基因 CsGS1、CsHEMA3 和 CsCLH4 可能参与了绿叶和黄叶茶树品种间茶氨酸的差异积累。PAL 和 4CL 是类黄酮生物合成途径中的限速酶，它们表达的下调可能是导致‘黄金芽’茶叶中类黄酮积累受抑制的原因。目前，对白化、紫色和绿色茶叶样品的比较主要集中在不同品种上，遗传背景的显著差异影响了茶树生化成分的组成。因此，遗传背景相似的茶树叶片颜色变化背后的代谢差异仍是一个未解决的问题。为了解决这个问题，研究人员建立了杂交群体来研究叶片颜色变化的可能机制。然而，完成这项工作需要数年时间。人工调控叶片颜色有望成为未来育种研究的一个引人注目的焦点。

喷施外源激素以改善植物生长和品质是常见的农艺措施，能产生快速效果。先前的研究表明，脱落酸和脱落酸合成抑制剂可能对叶片颜色产生显著影响。然而，关于脱落酸对茶叶颜色和代谢物影响的系统研究还很缺乏，其分子机制仍不清楚。因此，本研究对‘紫福星’的绿色新梢施加脱落酸和脱落酸合成抑制剂，以研究它们对茶叶颜色和代谢物（包括类黄酮和氨基酸）水平的影响。转录组和代谢组分析相结合，将有助于从分子角度阐明其潜在机制。本研究结果将为叶色特异性茶树品种的开发提供有价值的参考，并可能为茶叶加工提供高花青素和氨基酸含量的原料，提高附加值。

2 实验设计

在福建省武夷山市武夷星茶业有限公司茶树品种与种质资源圃（东经 117°950′，北纬 27°710′）种植了四个茶树品种，分别为‘福鼎大白茶’、‘白鸡冠’、‘紫福星’和‘紫娟’。这些品种均为 10 年生扦插苗。2019 年 9 月，在不同生长阶段（一芽一叶、第二叶、第三叶和第四叶）采集每个品种的健康新梢。每个样品获得 6 个生物学重复。新梢立即在液氮中冷冻，并在 - 80°C 下保存直至进一步分析。选择‘紫福星’品种进行激素处理，因为它对激素调节有响应。选择一排生长均匀的茶树，分为三组，每组 18 株。这些组分别称为对照组（喷施去离子水）、ABA 处理组（喷施 100μM ABA）和 Flu 处理组（喷施 50μM Flu）。使用喷雾瓶分别向每个处理组的茶树叶片表面均匀喷施 1 升配置好的 ABA 溶液、Flu 溶液和去离子水。根据先前的报道，处理 168 小时后，颜色和生理指标出现极端表型差异；因此，168 小时后采摘新鲜茶叶（一芽二叶）。所有在田间收集的材料立即在液氮中冷冻，并在 - 80°C 下保存，以备进一步分析。

3 结果

以‘福鼎大白茶’为代表的正常绿色品种，全年叶片均为绿色。相比之下，‘白鸡冠’的新梢为白化状，‘紫福星’和‘紫娟’的新梢为紫色。这些茶树品种已被广泛研究。紫色或白化茶树品种的颜色随着叶片成熟度的增加从紫色过渡到绿色（图 1A）。同时，叶绿素和类胡萝卜素水平有所增加（图 1B–E）。此外，花青素和 ABA 的含量在幼叶中相对较高，并随着叶片成熟而降低。有趣的是，在嫩梢中，特别是一芽一叶阶段，‘白鸡冠’的 ABA 水平最低，而‘紫福星’和‘紫娟’的 ABA 水平较高（图 1F 和 G）。

为进一步确认 ABA 在茶叶颜色形成中的作用，我们分别通过施加外源 ABA 和 ABA 抑制剂 Flu 来促进或阻断 ABA 的生物合成。ABA 处理成功诱导了 ABA 的生物合成，而 Flu 处理有效抑制了 ABA 的生物合成，这可通过 ABA 处理的茶叶中 ABA 水平显著升高和 Flu 处理的茶叶中 ABA 水平显著降低得到证明。与对照组相比，ABA 处理的叶片呈现明显的紫色，而 Flu 处理的叶片变为白化状（图 2A）。ABA 处理组的花青素浓度显著高于对照组和 Flu 处理组（Pt-test），表明花青素可能是 ABA 处理后叶片呈现紫色的原因（图 2B）。此外，Flu 处理显著降低了叶绿素和类胡萝卜素的含量（图 2C 和 D）。值得注意的是，总叶绿素含量的降低可能是导致白化叶与绿叶颜色差异的主要因素。

为进一步阐明茶树叶片颜色变化的化学基础，使用 UPLC-ESI-MS/MS 进行代谢组学分析。共鉴定出 1623 种代谢物，包括 356 种类黄酮、286 种酚酸、175 种氨基酸、155 种脂质、108 种生物碱、98 种有机酸、76 种木脂素和香豆素、63 种核苷酸及其衍生物、62 种萜类、50 种单宁和其他代谢物。通过主成分分析，将代谢物分为三个不同的组。对照组、ABA 处理组和 Flu 处理组的生物学重复表现出强烈的聚类模式。生物学重复的皮尔逊相关系数（R²）超过 0.9，表明代谢组学数据是可靠的。

根据代谢组学分析结果，对对照组、ABA 处理组和 Flu 处理组中的不同代谢物进行了分类。桑基图显示，一级代谢物（分类 I）包括氨基酸及其衍生物，以及类黄酮和酚酸。前三种二级代谢物（分类 II）是氨基酸及其衍生物、酚酸和黄酮（图 3A）。为展示不同处理组之间代谢物积累的差异，生成了热图（图 3B）。发现 ABA 处理组富含类黄酮，特别是飞燕草素 - 3-O - 葡萄糖苷、飞燕草素 - 3,5 - 二 - O - 葡萄糖苷、矢车菊素 - 3-O - 葡萄糖苷和矢车菊素 3 - 木糖苷。此外，在 Flu 处理组中，L - 谷氨酰胺、L -茶氨酸、L - 赖氨酸、L - 精氨酸和 L - 组氨酸等氨基酸及其衍生物的丰度较高。因此，对这些与不同处理相关的代谢物进行了进一步分析。共鉴定出 159 种差异丰度代谢物，满足 FC≥2 或 FC≤0.5 且 VIP≥1 的标准。火山图显示，与对照组相比，ABA 处理组中有 18 种上调代谢物和 38 种下调差异丰度代谢物（图 S1 和 Table S1）。同样，与对照组相比，Flu 处理组中有 31 种代谢物上调，33 种差异丰度代谢物下调（图 S1 和 Table S1）。重要的是，氨基酸占差异丰度代谢物的 26%，类黄酮占 18%。这些发现表明，这些特定的差异丰度代谢物可能对茶叶的颜色、风味和营养价值有显著影响（图 S2）。

为研究茶叶颜色变化的潜在机制，选择处理 7 天后收集的样品进行转录组分析。每个样品产生 > 5 Gb 的干净读数（Table S2），每个文库中约 89.06% 的读数与茶树 TGY 参考基因组完全匹配（Table S2），这使我们能够集中研究感兴趣的关键基因。在 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组中，分别鉴定出 1260 个（259 个上调和 1001 个下调）和 403 个（118 个上调和 285 个下调）差异表达基因（图 4A 和 B）。对这些差异表达基因进行了进一步分类，并使用 KEGG 分析对丰度最高的基因进行了研究（图 4C 和 D）。研究了每组中的前 20 条通路，发现在 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组中均存在 “苯丙烷生物合成”、“氨基酸代谢” 和 “硫代葡萄糖苷生物合成”。这表明这些代谢途径可能对茶叶的颜色变化有显著影响。此外，在 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组之间有 272 个差异表达基因重叠（图 4E）。展示差异表达基因聚类趋势的热图和 KEGG 富集分析结果表明，两组中上调基因在花青素和谷胱甘肽代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及囊泡运输中的 SNARE 相互作用等通路中显著富集。这些通路被充分证明与茶叶的颜色变化相关（图 4F）。

研究在 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组中分别鉴定出 82 个和 28 个差异表达的转录因子（图 5）。具体而言，我们重点分析了排名前 10 的转录因子。在 ABA 处理组与对照组中，鉴定出 25 个同源盒（HB）基因（4 个上调和 21 个下调）、19 个 bHLH 基因（6 个上调和 13 个下调）和 17 个 MYB 基因（9 个上调和 8 个下调）。在 Flu 处理组与对照组中，9 个基因（1 个上调和 8 个下调）被注释为 bHLH 基因，7 个 HB 基因（7 个下调）和 6 个 MYB 基因（1 个上调和 4 个下调）被鉴定出来。

为鉴定与茶叶中类黄酮和氨基酸沉积相关的差异丰度代谢物和差异表达基因，对 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组进行了比较。在 ABA 处理组中，与对照组相比，我们观察到 10 种代谢物的积累更高，包括表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、表没食子儿茶素 - 3-O - 没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、飞燕草素 - 3,5 - 二 - O - 葡萄糖苷、飞燕草素 - 3-O - 葡萄糖苷、矢车菊素 - 3-O - 葡萄糖苷和矢车菊素 3 - 木糖苷。相反，这些代谢物在 Flu 处理组中的积累低于对照组（图 6A）。在这些代谢物中，四种花青素在 ABA 处理组中显著积累，表明它们是紫色着色的主要贡献者。我们进一步分析了 28 个与花青素生物合成相关的候选结构基因的转录水平（ Table S2）。在上游途径中，从苯丙氨酸到柚皮素，我们观察到与对照组相比，ABA 处理组中 4 个 PAL、4 个 C4H、3 个 4CL、1 个 CHS 和 3 个 CHI 基因显著上调，表明它们参与上调花青素的沉积。随后，比较了参与柚皮素转化为花青素和儿茶素的基因的表达。F3H、DFR、ANS、UFGT、LAR 和 SCPL 基因在 ABA 处理组中与对照组相比始终上调，而在 Flu 处理组中与对照组相比表达水平较低。值得注意的是，一个 DFR 和两个 UFGT 基因在 ABA 处理组中与对照组相比上调了两倍以上。这些结果凸显了 DFR 和 UFGT 基因在茶叶中儿茶素和花青素沉积中的重要作用。

通过对 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组的比较，鉴定出与氨基酸相关的差异丰度代谢物和差异表达基因。与对照组相比，Flu 处理组中共有 15 种代谢物，即 L - 精氨酸、L - 茶氨酸、N - 单甲基 - L - 精氨酸、L - 天冬氨酸、L - 赖氨酸、高精氨酸、L - 谷氨酰胺、精氨酸甲酯、N (6)- 二甲基 - L - 赖氨酸、高脯氨酸、L - 组氨酸、L - 天冬酰胺、5 - 氧脯氨酸、L - 高甲硫氨酸和 N-α- 乙酰 - L - 鸟氨酸，积累量更高。另一方面，在 ABA 处理组中，有 13 种氨基酸被发现低于对照组（图 6A）。为鉴定参与氨基酸生物合成及其在茶叶中积累的关键基因，分析了 9 个候选结构基因的表达水平（Table S2）。谷氨酸（Glu）不仅是茶氨酸合成的前体，也是氮代谢中重要的初级代谢物。因此，谷氨酸的合成受到严格调控。鉴定出了 AlaT、AlaDC、TSI、GDH、GS 和 GOGAT 的表达。其中，AlaT 和 GOGAT 在 Flu 处理组中表达最高，而在 ABA 处理后所有这些基因的表达均最低。此外，我们研究了参与氮吸收和同化途径的基因。与对照组相比，Flu 处理组中 NR 增加了约 1.5 倍，而两个 NRT 基因在 Flu 处理组中与对照组相比增加了 3 倍以上。这些发现表明，Flu 处理增强了茶叶中的氮吸收和同化，从而促进了氨基酸的合成。此外，我们对总花青素、六种儿茶素和总氨基酸进行了定量，观察到的趋势与代谢组学分析一致（图 6B）。

为研究 ABA 和 Flu 处理后与花青素、儿茶素和氨基酸代谢相关的潜在调控基因，我们检查了 ABA 处理组与对照组以及 Flu 处理组与对照组中差异表达转录因子的表达模式。采用 K 均值差异表达基因聚类算法，根据不同处理组之间相似的表达模式生成四个聚类（图 S3）。选择在 ABA 和 Flu 处理中高表达的转录因子进行进一步分析。此外，为评估基因表达模式与平行代谢谱之间的相关性，我们对转录组和代谢组数据进行了共表达分析。在排除与任何代谢物相关性较低的基因后，我们进行了可视化分析以评估基因与代谢物之间的相关性。图 7A 描述了在 ABA 处理后，转录因子（3个 MYB：CsMYB9、CsMYB10 和 CsMYB16；1个 bHLH：CsbHLH2；2个 HB：CsHB15 和 CsHB20；1个 CCCH：CsCCCH3；1个 GATA：CsGATA；1个 MBD：CsMBD）与参与花青素合成的结构基因之间的连接线数量最多。同样，Flu 处理后，发现三个转录因子（CsMYB18、CsbHLH21 和 CsHMGA）通过相关结构基因调控九种氨基酸的合成。值得注意的是，参与氮吸收和同化途径的关键基因 CsNRT（2）和 CsNR（1）表现出大量的连接线（边），并且与代谢物有很强的关联（图 7B）。

为进一步深入了解 ABA 在叶片颜色调控中的调控网络，本研究检查了花青素、儿茶素和氨基酸与转录因子和结构基因之间的相关性（图 8，Table S4）。研究结果显示，与花青素和儿茶素相关的基因表达同氨基酸相关基因表达呈现显著负相关。反之，氨基酸相关基因的表达也与花青素和儿茶素相关基因表现出强烈的负相关关系。例如，CsMYB9、CsMYB16 和 CsbHLH2 与花青素、没食子儿茶素和非没食子儿茶素呈显著正相关，但与氨基酸呈显著负相关。此外，CsbHLH25、CsMYB20 和 CsHMGA 与氨基酸呈显著正相关，但与花青素、没食子儿茶素和非没食子儿茶素呈显著负相关。

为验证 RNA-seq 结果得出的基因表达模式的准确性和可靠性，我们从差异表达基因中选择了 16 个与花青素和氨基酸生物合成相关的候选基因和转录因子进行后续的 qRT-PCR 分析。结果显示，qRT-PCR 检测到的 16 个基因的表达模式与 RNA-seq 数据中观察到的模式高度一致，如图 9 所示。这种一致性为基于转录组的差异基因表达分析的可靠性提供了补充证据。

总之，我们的结果表明，ABA 处理后，茶树通过转录因子中的顺式作用元件对 ABA 做出响应，促进类黄酮合成途径中结构基因的表达。花青素的积累是茶树紫叶形成的原因。Flu 处理后，ABA 合成受到抑制，类黄酮（包括花青素和儿茶素）的合成减少。同时，发生叶绿素降解，导致叶片白化。这也为氨基酸合成提供了氮源，导致氨基酸含量增加。基于这些结果，我们提出了一个颜色变化模型（图 10）。碳氮代谢的平衡是紫色和白化茶叶中类黄酮和氨基酸相互变化的原因。需要未来的实验来进一步了解 ABA 如何调控类黄酮和氨基酸的代谢。本研究为 ABA 参与茶树叶片颜色变化提供了有价值的见解，有望在未来提高栽培茶树的经济价值。

来源：松树抗逆育种一点号